烟草抗青枯病突变体的鉴定与转录组分析

发布时间：2020-10-29 08:36

　　 烟草青枯病(Tobacco Bacterial Wilt)由青枯菌(Ralstonia solanacearum)引起的毁灭性土传细菌性病害,对烟草的产量、品质和土地的综合利用带来了巨大的危害,是制约我国烟草行业发展的瓶颈之一。培育抗病品种是迄今防治青枯病最有效的途径,本研究首先对福建泰宁和安徽宣城烟草青枯菌系分化进行了研究;其次,建立了青枯病抗性的室内精准鉴定体系,然后对14个突变体及三个对照品种进行了青枯病抗性鉴定,对其抗性遗传规律进行了初步分析;最后,通过RNA-Sequencing技术揭示了烟草与病原菌互作过程中差异表达基因的情况,结合qRT-PCR技术对其中参与抗青枯病的差异基因进行了表达量分析,为抗性机理研究和烟草青枯病的防治提供遗传资源和理论依据。主要研究结果如下:1.对福建泰宁和安徽宣城菌株分别接种3种双糖(乳糖、麦芽糖、纤维二糖)和3种已醇(甘露醇、山梨醇、甜醇)进行生化指标测定。结果显示,15d后两地菌株在各培养基上均能够正常生长,且供试菌株在各培养基上生长的菌落呈橘黄色,3种双糖和3种已醇均能被供试菌株利用,因此,根据相关文献描述,推断供试菌株为生化型III;这也与己报道的侵染中国烟草的青枯菌主要为生化型III相符合。2.利用感病对照“红花大金元”、“翠碧一号”和抗病对照“岩烟97”三个对照品种为研究对象,探索室内精准鉴定体系,结果显示,利用伤根浸泡法,以1×10~8 cfu/mL浓度的青枯菌悬液进行浸染、第12d调查获得的发病情况主要评价指标,供试材料的室内病情指数与文献报道的真实病情指数一致,由此可见,室内可控条件下的伤根浸泡法能够真实地反映材料的抗性水平,具有快速、经济、可靠的优点,可以作为烟草青枯病抗性鉴定的重要手段。3.选用14个经EMS诱变获得的烟草抗青枯病突变体及“红花大金元”、“翠碧一号”、“岩烟97”三个对照品种为材料进行室内接种鉴定,结果显示,17个供试材料的室内抗病率与田间自然病圃抗病率非常接近,呈极显著正相关,相关系数为0.964,评价了突变体的抗性;利用感病亲本“翠碧一号”和“红花大金元”,分别与抗病亲本359-k、633-k、N1561-1、1412-k1分别配制正反交组合,初步表明突变体青枯病抗性遗传受隐性核基因控制。4.对抗青枯病突变体和感病材料“翠碧一号”接种青枯菌强毒株后进行转录组测序,结果分析发现,通过RNA-Sequencing技术筛出了大量的差异基因,且差异基因主要以上调为主。青枯菌的侵染会启动烟草多条代谢通路,如植物激素信号转导、植物-病原菌的互作、氧化磷酸化和嘧啶代谢等,以及相关基因的表达,主要涉及信号转导机制、催化活性、有机物代谢、生物合成等,这也表明烟草-病原菌互作是非常复杂的网络过程。5.选取了8个可能和抗病性相关的差异表达基因在野生型和突变体633-k、1412-k1中进行了qRT-PCR验证,以确定是否参与了烟草抗青枯病反应,结果表明,Ntab0876820和Ntab0833810基因在抗感材料接菌后的表达强度不同,在突变体633-k、1412-k1中,其表达强度随着接种天数的增加而增加,而在野生型侵染前后表达强度无明显变化。Ntab0876820基因中含有WRKY转录因子,Ntab0833810参与细胞的氧化还原反应。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.72
【部分图文】：

是世界烟草生产中危害最严重的细菌性病害之一，严重影响烟草的产量与品（Tans-Kersten et al.,2010）。自 1880 年首先在美国的北卡罗来纳州格兰维尔（Granville，县名现以来，现已在世界各大烟草种植区均有发现，在介于北纬 450至南纬 450之间的亚热带和一些暖的烟草种植区发病情况尤为明显，在我国烟草青枯病普遍发生，其中南方烟区最为严重，且病害常与黑胫病、根结线虫病等根茎类病害混合发生（刘勇等，2007）。近年来，该病害分布区逐步扩大，山东、河南、辽宁等烟区亦有分布。福建省平均烟草青枯病发病率高达 40%；湖南青枯病发病率在中西部约为 10～30%，严重的达 40～85%；安徽省青枯病病情发展速度非常快2006 年病害面积超过 500hm2，除土地利用损失以外，直接经济损失高达300万元（季学军等，200国内外每年因烟草青枯病造成数亿元的经济损失，青枯病成为影响烟草生产第四大细菌性病害1.1.2 病害症状烟草青枯病（Tobacco Bacterial Wilt）为典型的维管束病害，病菌可侵害烟株根、茎、叶的部分。烟草青枯病最典型的症状是叶片枯萎及茎部一侧发黑。发病时期，病株的茎上一侧有褪条斑、叶片萎焉，而一侧茎部生长正常、叶片正常。发病中期，烟株茎部从褪绿条斑变为黑色斑，可一直延伸烟株顶部，叶肉变黄且叶脉变黑，叶片全部萎焉，这时拨出根部，带有条斑的和根部变黑腐烂，用力挤压发病处有黄白色乳状粘液，即青枯菌 菌脓 （徐德树等，2010）。病后期，青枯菌侵入髓部，随后髓部呈蜂窝状或腐烂变空，直至整株枯死（图 1.1）。

中取得了丰富成果，如水稻抗白枯病基因 Xa1、Xa2，拟南等（1997）利用 EMS 诱导烟草花药，进行筛选鉴定出抗黄院烟草研究所生物技术研究中心所牵头烟草突变体库创插入等突变方式对红花大金元、中烟 100、岩烟 97 等主栽、香气、品质等接近应用于生产的突变体，而且还有叶色突变体，为功能基因的研究和品种培育提供了资源。测序技术的原理和应用组测序的原理是基于二代高通量测序技术建立起来的，具有适用性强、测范围广等优点，因此转录组测序技术已被广泛应用于基祁云霞等，2011）。转录组测序主要包括总 RNA 的提取、等步骤，具体流程见（图 1.2）。数据分析是转录组测序的、富集分析、主成分分析、代谢通路分析，获得转录组信为品种繁育、分子标记开发等提供大量数据资料。

试验技术流程
【参考文献】

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1 徐进;许景升;张昊;冯洁;顾钢;;烟草品种青枯病抗性的组培苗接种鉴定方法研究[J];中国烟草科学;2016年05期

2 孙亭亭;王大伟;龚达平;陈乐;陈雅琼;孙玉合;;番茄B3超家族成员鉴定及生物信息学分析[J];植物遗传资源学报;2015年04期

3 吴超;夏岩石;吕永华;李荣华;赵伟才;邱妙文;郭培国;;烟草青枯病抗性分子标记的研究进展[J];分子植物育种;2015年04期

4 范江;刘勇;李永平;周冀衡;;烟草苗期青枯病抗性鉴定及其抗性评价方法的比较[J];云南农业大学学报(自然科学);2014年04期

5 郑雪坳;宋波涛;谭晓丹;陈惠兰;;马铃薯青枯病病原的鉴定[J];中国马铃薯;2014年02期

6 孙学永;王新胜;张丽娜;钱益亮;;烟草青枯病抗性的遗传分析[J];中国农学通报;2013年34期

7 江香梅;伍艳芳;肖复明;熊振宇;徐海宁;;樟树5种化学类型叶片转录组分析[J];遗传;2014年01期

8 党峰峰;雷玉芬;官德义;王再兴;何水林;;辣椒种质资源抗青枯病的鉴定与评价[J];植物科学学报;2013年04期

9 孙丽萍;时焦;孟坤;雒振宁;张峻铨;王凤龙;;利用赤星病菌毒素快速高通量鉴定烟草抗性种质的方法研究[J];中国烟草科学;2014年01期

10 李小白;向林;罗洁;胡标林;田胜平;谢鸣;孙崇波;;转录组测序(RNA-seq)策略及其数据在分子标记开发上的应用[J];中国细胞生物学学报;2013年05期

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3 李智奕;国内不同烟草品种的烟叶转录组分析[D];河南农业大学;2014年

4 贾春燕;烟草青枯病菌的分子检测与烟草品种抗病性研究[D];山东农业大学;2011年

5 邹阳;重庆烟草青枯菌生理分化及致病型测定研究[D];西南大学;2007年

本文编号：2860650