四类天然产物的生物活性评价及作用机制研究

发布时间：2020-10-30 12:46

　　 病虫害严重危害农业生产效益和可持续健康发展,造成巨大的经济损失。目前,化学药物仍是控制农业病虫害的主要方式,但其带来的药物残留、耐药性和再猖獗等问题给生态环境保护、公共卫生和食品安全造成潜在威胁。由于天然产物的高效、低毒和对环境友好等特点,从中发现天然源农用药物已成为新的研究热点,具有广阔的应用前景。在前期研究的基础上,本论文以立枯丝核菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌等植物常见病原真菌及褐飞虱、东方粘虫等作物害虫和兔痒螨等动物外寄生虫为研究对象,对吲哚并喹啉类生物碱、简单苯丙素类化合物、醌类及香豆素类化合物等天然产物的杀菌、杀虫及杀螨生物活性进行研究,探讨其作用机理,以期发现安全、高效的先导化合物。1.吲哚并喹啉类生物碱杀菌活性评价及作用机理研究吲哚并喹啉类生物碱具有良好的抗菌和抗肿瘤活性,在前期对新白叶藤碱衍生物抗植物病原真菌活性研究基础上,对其母核结构的杀菌活性及作用机理进行进一步研究。以立枯丝核菌和稻瘟病菌为研究对象,对吲哚并喹啉类生物碱新白叶藤碱、白叶藤碱及异白叶藤碱的杀菌活性研究时发现,新白叶藤碱的杀菌活性较好;进一步研究表明,新白叶藤碱具有较广的杀菌谱,对立枯丝核菌毒力最强;应用蛋白组学、转录组学及基于表面等离子共振的分子捕捉技术和其它分子生物学技术对其杀菌作用机理研究表明,新白叶藤碱通过作用于线粒体复合酶III的Fe-S蛋白亚基显著抑制其酶活性,阻断电子传递链和能量代谢,进而造成菌丝死亡。同时,新白叶藤碱的杀菌活性也可能与细胞核功能的抑制有关。2.简单苯丙素类化合物生物活性评价及作用机理研究简单苯丙素类在植物中分布较为广泛,本文选取8种简单苯丙素类化合物,对其杀菌、杀虫、杀螨活性和作用机理进行研究。杀菌活性研究发现,简单苯丙素类化合物对植物病原菌具有一定的生长抑制活性,其中,大部分苯丙素类化合物对立枯丝核菌的毒力较强,对小麦赤霉病菌的毒力较弱。所测化合物中,异丁香酚的杀菌活性最好且杀菌谱较宽,浓度为50μg/mL时对油菜菌核病菌、立枯丝核菌及番茄灰霉病菌的抑制率分别为86.05%、78.67%和53.89%。杀虫活性研究发现,丁香酚对褐飞虱的杀虫活性最好,LC_(50)为89.22μg/mL;乙酸丁香酚酯对东方粘虫的杀虫活性较好,与阳性对照药物川楝素相当。杀螨活性及作用机理研究发现,丁香酚具有良好的体外杀螨活性,且能有效治愈患螨病兔;应用转录组学和分子捕捉等分子生物学技术研究首次发现,丁香酚通过作用于螨虫线粒体呼吸链复合酶I链2的Phe198、Glu211和Lys288氨基酸残基抑制其酶活性,进而阻断电子传递链和能量产生,导致螨虫死亡,其对复合酶I链2的结合具有种属选择性,对昆虫更为敏感,毒性更大,但对哺乳动物较为安全。3.醌类化合物生物活性评价及作用机理初探醌类化合物是一类重要的植物次级代谢产物,本文中我们对其杀菌、杀虫及杀螨生物活性及可能的作用机理进行研究。杀菌活性及作用机理研究表明,大部分醌类化合物对植物病原菌具有较强毒力,其中蓝雪醌的杀菌活性最好且杀菌谱较广,对8种植物病原菌的EC_(50)值为2.84-10.53μg/mL,优于阳性对照药物嘧菌酯;蓝雪醌处理立枯丝核菌后导致菌丝形态发生变化,细胞膜渗透性增加而引起内容物外流,线粒体肿胀且膜电位降低和活性氧簇发生富集,细胞核被破坏;蓝雪醌通过作用于立枯丝核菌的多个靶点而发挥其杀菌活性,对线粒体和细胞核的影响较为显著。杀虫及酶抑制活性研究发现,醌类化合物对褐飞虱的杀虫活性优于东方粘虫,其中,大黄素对褐飞虱和东方粘虫的杀虫活性最好,LC_(50)分别为84.30μg/mL和548.74μg/mL;通过酶活性抑制实验对其杀虫机理研究初步发现,大黄素显著抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的活性,且激活细胞色素P450s的活性,杀虫机理可能与通过诱导激活P450s而增加昆虫对药物的敏感性、以及通过抑制GST活性阻断II相代谢系统有关,神经系统和运动功能障碍也是导致昆虫死亡的重要原因。杀螨及酶抑制活性研究发现,胡桃醌和蓝雪醌的体外杀螨活性最好,能有效治愈患螨病兔,且无皮肤刺激性;两个化合物的杀螨活性可能与螨虫的神经传导和运动功能的破坏等有关。细胞毒性研究表明,蓝雪醌和大黄素对人正常肝细胞具有潜在的毒性,且前者对角质形成细胞的毒性较大,其临床使用仍需进一步研究;胡桃醌的细胞毒性较弱。4.香豆素化合物生物活性评价及作用机理初探香豆素类化合物具有良好的抗肿瘤、抗炎、抗病毒和抗细菌等活性,本文中对香豆素类化合物的杀菌、杀虫及杀螨活性进行研究。杀菌活性及作用机理研究表明,在所测试的香豆素类化合物中,4-甲氧基香豆素对立枯丝核菌的杀菌活性最好,优于阳性对照药物嘧菌酯,其能引起立枯丝核菌细胞膜破坏和渗透性增加,导致内容物的外泄,同时降低线粒体膜电位并富集活性氧簇,引起菌丝死亡。4-甲氧基香豆素可能通过细胞膜和线粒体发挥作用而导致菌丝死亡。杀虫及酶抑制活性研究发现,6-甲氧基当归素的杀褐飞虱活性最好,LC_(50)为122.7μg/mL,显著抑制AChE、GST活性和激活P450s活性,可作为I相代谢中P450诱导剂促使虫体对药物敏感,随后通过抑制虫体的解毒作用导致褐飞虱死亡;4-甲氧基香豆素对东方粘虫毒力较强。杀螨及细胞毒性研究发现,4-甲氧基香豆素的杀螨活性最好;4-甲氧基香豆素和6-甲氧基当归素对人正常肝细胞和角质形成细胞的毒性较弱或无毒性,IC_(50)均大于100μg/mL。本研究中首次发现新白叶藤碱的杀菌活性,阐明了其杀菌作用机制;明确了简单苯丙素类、醌类及香豆素类化合物对植物病原菌、作物害虫及兔痒螨的毒力,发现丁香酚、大黄素、胡桃醌、蓝雪醌、6-甲氧基当归素、4-甲氧基香豆素等具有良好杀菌、杀虫和杀螨活性的化合物;初步研究了蓝雪醌、4-甲氧基香豆素的杀菌作用机理,探讨了大黄素、胡桃醌、蓝雪醌、6-甲氧基当归素和4-甲氧基香豆素的杀虫、杀螨作用方式,阐明了丁香酚杀螨作用靶点,为后续四类天然产物的研究利用提供基础数据。
【学位单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S481
【部分图文】：

第一章 文献综述危害农业生产效益和健康发展, 造成严重的经计，全世界农业因有害生物每年造成的经济损食生产每年因病害损失 10%、虫害达 14%，带物病虫害总体处于比较严重的发生状态，导致重威胁粮食安全。2006-2015 年间每年病虫次，占粮食总产量的 3.53%，其中玉米、水稻和、33.67%及 23.31%（图 1-1）[5]。畜牧业作为农害同样严重威胁农业养殖业正常生产，以动物动物生产性能及畜产品质量下降，甚至死亡[6]，

前者对玉米小斑病菌活性最好，EC50为 29.3 μg/mL；后者对核盘菌较为敏感[35]；quinolactacide 和 yaequinlone（图1-2）对马铃薯晚疫病菌和冬枣锈病菌也具有较好的抑制活性，MIC 分别为 8 和4 μg/mL[36,37]。Teichert 等 从 蘑 菇 状 真 菌 Cortinarius subtortus 中 分 离 出 的6-hydroxyquinoline-8-carboxylic acid（图 1-2）喹啉生物碱显著抑制马铃薯炭疽病菌菌丝生长，浓度为 18.9 μg/mL 时抑制率为 71%[38]；夹竹桃（Nerium indicum）内生真菌 Penicillium sp. R22 发酵液中喹啉酮 3-O-methylviridicatin 和青霉醇对白菜黑斑病菌和苹果腐烂病菌具有较强毒力[39]；目前，以喹啉环为母核设计、合成

[43]。1999年，Sarma等研究发现延胡索（Fumaria indica）中碘化小檗碱（图1-3）能显著抑制新月弯孢菌、白粉病菌、镰刀菌和青霉属病菌的孢子萌发[44]；石蒜科植物中二氢水仙克拉辛-4-O-α-L-阿拉伯糖苷也具有良好的抗菌活性，浓度为10 μg/mL时对稻瘟病菌和黄萎病菌的生长抑制率均超过60 %[45]。图 1-3 具有抗农业病菌活性的异喹啉类生物碱Figure 1-3. The chemical structure of isoquinoline alkaloids with the anti-phytopathogen activity1.1.1.3 吲哚类生物碱吲哚生物碱是另外一类较为重要的生物碱。Singh 等研究了吲哚生物碱venenatin（e图 1-4）对几种植物病原菌的抑菌活性，结果显示其对 Fusarium udum、黑斑病菌、Ustilago cynodontis、黄曲霉具有高敏感性，浓度为 2000 μg/mL 时能显著抑制孢子萌发，且对豌豆白粉病有良好的防效[46]。从 Zanthoxylumusambarense 中分离出的铁屎米酮（图 1-4）显著抑制球毛壳菌、出芽短梗霉、岛青霉、树脂枝孢霉、黑曲霉和黄曲霉等霉菌的生长，MIC 均为 5.5 μg/mL[47]；来自 Streptomyces sp.的吲哚生物碱 chloroindole 和 streptochlorin（图 1-4）也具有一定的杀菌活性[48, 49]。图 1-4 具有抗农业病菌活性的吲哚类生物碱Figure 1-4. The chemical structure of indole alkaloids with the anti-phytopathogen activity1.1.1.4 β-咔啉及甾体类生物碱Olmedo 等研究了六个β-咔啉（β-carbolines）类生物碱抗绿霉病菌和灰霉病菌的生物活性，为蔬菜水果的采后保鲜提供理论支持。结果发现：哈尔明碱、哈尔醇、去甲哈尔满和哈尔满碱（图 1-5）抑制了分生孢子的萌发, 其中哈尔醇的抗菌活性均最好

本文编号：2862496