色氨酸代谢与棉花抗黄萎病免疫调控
发布时间：2020-11-04 01:57
植物可以产生很多初生和次生代谢物以维持正常的生长发育和抵御外界环境胁迫,而这些具有防御性的代谢物质大多都来源于氨基酸合成和代谢路径。虽然棉花含有丰富的次生代谢物质,但是这些物质在棉花中的合成路径以及在棉花生长发育和防御反应中的作用并不清楚。本研究前期通过拟南芥芯片表达谱数据,并结合棉花响应黄萎病菌的RNA-Seq数据和抑制差减杂交文库,发现色氨酸合成路径基因GbTSA1受多种真菌诱导表达,推测该基因可能参与了植物广谱响应真菌侵染的抗病信号路径或免疫调控。本研究基于以上结果对色氨酸合成路径相关基因在棉花抗黄萎病中的功能进行了解析,取得主要结果如下:1.GbTSA1表达模式分析组织表达模式分析显示GbTSA1在棉花各个组织(根,茎秆,叶片,花瓣,0 d胚珠,5 d纤维)中均高量表达;诱导表达模式分析显示GbTSA1在棉花接种黄萎病菌初期表达显著下降,在接种24 h后表达显著上调,同时该基因也受水杨酸处理诱导上调表达;亚细胞定位结果显示GbTSA1基因编码的蛋白定位于叶绿体中。2.GbTSA1抑制表达材料增强棉花对黄萎病的抗性为了研究GbTSA1在棉花抗病中的功能,我们构建了GbTSA1超量表达载体,RNAi抑制表达载体以及病毒诱导的基因沉默载体,并获得超表达株系(OS-2,OS-3,OS-5,OS-8)和抑制表达株系si-1。研究发现,抑制GbTSA1表达的转基因株系si-1出现类病斑表型,同时伴随SA合成路径以及PR基因的显著激活。利用病毒载体TRV:TSA1抑制GbTSA1表达后植株表现出与si-1相似的类病斑表型。进一步研究发现,抑制GbTSA1表达后增强棉花对黄萎病菌的抗性,而超量表达GbTSA1后对棉花黄萎病的抗性影响不大。3.GbTSA1抑制表达材料表型形成依赖于水杨酸合成和信号路径为了研究si-1以及TRV:TSA1抑制表达植株类病斑的形成机制,本研究将水杨酸合成路径关键基因GbICS1以及信号路径关键基因GbNPR1分别与GbTSA1进行共抑制,结果表明共抑制GbICS1和GbNPR1后可以恢复TRV:TSA1抑制表达植株引发的类病斑及抗病的表型,说明水杨酸合成的组成型激活是导致TRV:TSA1抑制表达植株出现坏死的原因。4.吲哚激活棉花抗病免疫反应和SA合成由于色氨酸合成路径和水杨酸合成路径共用前体底物分支酸,为了解析si-1以及TRV:TSA1抑制表达植株引发水杨酸含量升高的机制,我们对整个色氨酸合成路径进行了系统的研究,结果显示类病斑表型的出现具有基因特异性,且不是由分支酸和色氨酸含量变化所致。此外,TRV:TSB1抑制表达植株也出现依赖于水杨酸信号路径的类病斑表型。酵母双杂交实验表明GbTSB1可以和GbTSA1互作形成复合体催化色氨酸合成的最后一步反应;代谢组分析发现TRV:TSA1和TRV:TSB1抑制表达植株吲哚以及吲哚类代谢物显著积累;转录组分析发现吲哚可以激活抗病相关基因以及水杨酸合成相关基因GbSARD1,GbWRKY28等的表达;双荧光素酶实验证明GbSARD1和GbWRKY28可以结合在GbICS1的启动子上,激活GbICS1的表达;共抑制GbSARD1可以部分恢复TRV:TSA1和TRV:TSB1抑制表达植株类病斑表型;吲哚外施处理显示吲哚可以增强棉花对黄萎病菌的抗性;以上结果表明,抑制GbTSA1和GbTSB1的表达能促进其代谢底物吲哚以及吲哚类物质在抑制表达植株中显著积累,吲哚类物质可以通过激活SA合成关键转录因子GbSARD1以及GbWRKY28的表达,最终导致TRV:TSA1和TRV:TSB1抑制表达植株中SA含量显著升高,PR基因组成型激活,植株出现类病斑和抗病表型。5.GbTRP1抑制表达植株积累邻氨基苯甲酸类物质本研究还发现色氨酸合成路径基因GbTRP1抑制表达植株以及GbTRP1-RNAi转基因株系也会产生类病斑表型,但在TRV:TRP1抑制表达植株中SA含量显著降低。代谢组分析发现邻氨基苯甲酸及其衍生物在TRV:TRP1抑制表达植株中显著积累。后续实验需要进一步探讨TRV:TRP1抑制表达植株和GbTRP1-RNAi转基因株系出现类病斑的机制以及邻氨基苯甲酸与水杨酸(邻羟基苯甲酸)在植物抗病反应中的联系。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.621
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
1.1 植物抗病机制
1.1.1 植物先天免疫系统
1.1.2 植物超敏反应和类病斑突变体参与的抗病反应
1.1.3 植物氨基酸代谢参与的抗病反应
1.1.4 植物激素水杨酸介导的抗病反应
1.2 棉花黄萎病及抗病机制解析
1.2.1 棉花黄萎病菌致病机制
1.2.2 棉花对黄萎病菌的组织结构抗性
1.2.3 棉花中R基因介导的抗性及机制解析
1.2.4 激素信号路径在棉花抗黄萎病菌中的作用
1.2.5 次生代谢物质在棉花抗黄萎病菌中的作用
1.3 色氨酸合成和代谢路径在植物抗病中的作用
1.3.1 色氨酸合成路径研究进展
1.3.2 色氨酸代谢路径在抗病和抗虫反应中的作用
1.4 研究问题的由来与意义
2 材料方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料,载体和菌株
2.1.2 试剂
2.2 实验方法
2.2.1 GbTSA1 基因的分离和克隆
2.2.2 载体构建
2.2.3 棉花遗传转化
2.2.4 棉花核酸提取和Southern杂交
2.2.5 反转录以及RT-qPCR基因表达量分析
2.2.6 黄萎病菌的活化和培养、接种、病指统计、恢复培养
2.2.7 水杨酸,色氨酸,吲哚处理棉花
2.2.8 病毒诱导的基因沉默（VIGS）
2.2.9 HPLC-MS法测量棉花内源激素,色氨酸,以及分支酸含量
2.2.10 GC-MS法测量吲哚含量
2.2.11 GbTSA1 基因亚细胞定位
2.2.12 酵母双杂交和双荧光素酶报告实验
2.2.13 吲哚处理转录组分析
3 结果分析
3.1 GbTSA1 基因的克隆及分子检测
3.1.1 棉花中Gb TSA1 基因的分离和克隆
3.1.2 GbTSA1 基因蛋白亚细胞定位,组织表达模式和诱导表达模式
3.2 GbTSA1 转基因材料的表型鉴定
3.2.1 GbTSA1 转基因株系的获得及表型鉴定
3.2.2 TRV:TSA1 抑制表达植株表型鉴定
3.3 GbTSA1 超表达转基因植株和抑制表达植株抗病性鉴定
3.4 GbTSA1-RNAi以及TRV:TSA1 植株类病斑形成依赖于SA合成和信号转导路径
3.4.1 共沉默Gb ICS1或GbNPR1 抑制TRV:TSA1 植株类病斑表型
3.4.2 共沉默GbICS1或Gb NPR1 抑制TRV:TSA1 植株抗病表型
3.4.3 外施SA可以显著增强棉花对黄萎病菌的抗性
3.5 类病斑表型在色氨酸合成路径中具有基因特异性且不依赖于色氨酸
3.5.1 色氨酸合成路径基因在棉花中的克隆和挖掘
3.5.2 TRV:Trp-synthesis related genes抑制表达植株的表型鉴定
3.5.3 外施色氨酸不能抑制TRV:TRP1,TRV:TSA1,TRV:TSB1 植株类病斑表型
3.6 TRV:TSB1 抑制表达植株类病斑表型依赖于SA信号路径
3.7 外源施加吲哚可以增强植物抗病反应以及SA信号路径
3.7.1 TRV:TSA1和TRV:TSB1 抑制表达植株吲哚以及吲哚类衍生物含量测定..
3.7.2 外源施加吲哚增强棉花对黄萎病菌的抗性
3.7.3 吲哚处理转录组分析
3.7.4 吲哚激活SA合成相关转录因子GbSARD以及GbWRKY28 的表达
3.7.5 外源施加吲哚不能抑制黄萎病菌的生长
3.8 GbTRP1-RNAi和 TRV:TRP1 抑制表达植株增强棉花对黄萎病菌以及灰霉的抗性
3.9 TRV:TRP1 抑制表达植株中积累大量邻氨基苯甲酸类物质
3.10 TRV:Trp-synthesis related genes植株类病斑表型以及抗病表型形成机制总结
4 讨论
4.1 VIGS技术在候选基因功能验证中的作用
4.2 色氨酸合成和代谢路径与SA信号路径之间的关系
4.3 植物类病斑突变体与SA信号路径之间的关系
4.4 邻氨基苯甲酸类物质具有抑菌作用
4.5 吲哚类代谢物质在棉花抗黄萎病中的作用
参考文献
附录
附录1 载体构建
附录2 DNA提取
附录3 Sourthern杂交（地高辛标记法）
附录4 棉花RNA提取
附录5 培养基配方
附录6 酵母双杂交实验
附录7 原生质体分离和转化以及双荧光素酶报告基因检测
附表
攻读学位期间已发表的论文和待发表的论文
申请专利
致谢
【参考文献】
本文编号：2869436
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.621
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
1.1 植物抗病机制
1.1.1 植物先天免疫系统
1.1.2 植物超敏反应和类病斑突变体参与的抗病反应
1.1.3 植物氨基酸代谢参与的抗病反应
1.1.4 植物激素水杨酸介导的抗病反应
1.2 棉花黄萎病及抗病机制解析
1.2.1 棉花黄萎病菌致病机制
1.2.2 棉花对黄萎病菌的组织结构抗性
1.2.3 棉花中R基因介导的抗性及机制解析
1.2.4 激素信号路径在棉花抗黄萎病菌中的作用
1.2.5 次生代谢物质在棉花抗黄萎病菌中的作用
1.3 色氨酸合成和代谢路径在植物抗病中的作用
1.3.1 色氨酸合成路径研究进展
1.3.2 色氨酸代谢路径在抗病和抗虫反应中的作用
1.4 研究问题的由来与意义
2 材料方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料,载体和菌株
2.1.2 试剂
2.2 实验方法
2.2.1 GbTSA1 基因的分离和克隆
2.2.2 载体构建
2.2.3 棉花遗传转化
2.2.4 棉花核酸提取和Southern杂交
2.2.5 反转录以及RT-qPCR基因表达量分析
2.2.6 黄萎病菌的活化和培养、接种、病指统计、恢复培养
2.2.7 水杨酸,色氨酸,吲哚处理棉花
2.2.8 病毒诱导的基因沉默（VIGS）
2.2.9 HPLC-MS法测量棉花内源激素,色氨酸,以及分支酸含量
2.2.10 GC-MS法测量吲哚含量
2.2.11 GbTSA1 基因亚细胞定位
2.2.12 酵母双杂交和双荧光素酶报告实验
2.2.13 吲哚处理转录组分析
3 结果分析
3.1 GbTSA1 基因的克隆及分子检测
3.1.1 棉花中Gb TSA1 基因的分离和克隆
3.1.2 GbTSA1 基因蛋白亚细胞定位,组织表达模式和诱导表达模式
3.2 GbTSA1 转基因材料的表型鉴定
3.2.1 GbTSA1 转基因株系的获得及表型鉴定
3.2.2 TRV:TSA1 抑制表达植株表型鉴定
3.3 GbTSA1 超表达转基因植株和抑制表达植株抗病性鉴定
3.4 GbTSA1-RNAi以及TRV:TSA1 植株类病斑形成依赖于SA合成和信号转导路径
3.4.1 共沉默Gb ICS1或GbNPR1 抑制TRV:TSA1 植株类病斑表型
3.4.2 共沉默GbICS1或Gb NPR1 抑制TRV:TSA1 植株抗病表型
3.4.3 外施SA可以显著增强棉花对黄萎病菌的抗性
3.5 类病斑表型在色氨酸合成路径中具有基因特异性且不依赖于色氨酸
3.5.1 色氨酸合成路径基因在棉花中的克隆和挖掘
3.5.2 TRV:Trp-synthesis related genes抑制表达植株的表型鉴定
3.5.3 外施色氨酸不能抑制TRV:TRP1,TRV:TSA1,TRV:TSB1 植株类病斑表型
3.6 TRV:TSB1 抑制表达植株类病斑表型依赖于SA信号路径
3.7 外源施加吲哚可以增强植物抗病反应以及SA信号路径
3.7.1 TRV:TSA1和TRV:TSB1 抑制表达植株吲哚以及吲哚类衍生物含量测定..
3.7.2 外源施加吲哚增强棉花对黄萎病菌的抗性
3.7.3 吲哚处理转录组分析
3.7.4 吲哚激活SA合成相关转录因子GbSARD以及GbWRKY28 的表达
3.7.5 外源施加吲哚不能抑制黄萎病菌的生长
3.8 GbTRP1-RNAi和 TRV:TRP1 抑制表达植株增强棉花对黄萎病菌以及灰霉的抗性
3.9 TRV:TRP1 抑制表达植株中积累大量邻氨基苯甲酸类物质
3.10 TRV:Trp-synthesis related genes植株类病斑表型以及抗病表型形成机制总结
4 讨论
4.1 VIGS技术在候选基因功能验证中的作用
4.2 色氨酸合成和代谢路径与SA信号路径之间的关系
4.3 植物类病斑突变体与SA信号路径之间的关系
4.4 邻氨基苯甲酸类物质具有抑菌作用
4.5 吲哚类代谢物质在棉花抗黄萎病中的作用
参考文献
附录
附录1 载体构建
附录2 DNA提取
附录3 Sourthern杂交（地高辛标记法）
附录4 棉花RNA提取
附录5 培养基配方
附录6 酵母双杂交实验
附录7 原生质体分离和转化以及双荧光素酶报告基因检测
附表
攻读学位期间已发表的论文和待发表的论文
申请专利
致谢
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 刘琳琳;张文文;周易;苗玉焕;许莲;刘敏;张坤;张献龙;朱龙付;;棉花与番茄抗棉花黄萎病不依赖于Ve1[J];中国科学:生命科学;2014年08期
2 徐理;朱龙付;张献龙;;棉花抗黄萎病机制研究进展[J];作物学报;2012年09期
3 张新华;李富军;;病毒诱导的基因沉默技术及其在植物中的研究进展[J];西北植物学报;2012年02期
相关博士学位论文 前1条
1 金双侠;棉花遗传转化体系的优化及突变体的创制[D];华中农业大学;2006年
本文编号：2869436
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/dzwbhlw/2869436.html
