亚洲玉米螟MAPK基因克隆及其对亚致死浓度生物农药Cry1Ab处理的响应

发布时间：2020-11-04 07:48

　　 本文研究了亚洲玉米螟Ostria furnacalis(Guenee)幼虫体内丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase,MAPK)的功能,进一步探究了 Bt 毒蛋白 Cry1Ab 对亚洲玉米螟MAPK基因及其他免疫和应激相关基因的调控机制。采用RACE方法克隆获得了亚洲玉米螟MAPK基因的cDNA全长序列,对MAPK基因序列进行了生物信息学分析,成功完成MAPK蛋白的可溶原核表达,利用Western blotting验证了目标蛋白,并制备了多克隆抗体,初步进行了 MAPK蛋白的细胞及组织定位。利用亚致死剂量LC30的Bt毒蛋白Cry1Ab喂饲处理了亚洲玉米螟4龄幼虫,利用qRT-PCR技术分析了亚致死剂量Cry 1 Ab-LC30处理对MAPK基因以及其他相关基因转录水平的影响;RNAi技术抑制MAPK基因表达后利用qRT-PCR技术分析MAPK及其他相关基因转录水平的影响;利用亚致死剂量的Cry1Ab-LC30处理亚洲玉米螟4龄幼虫后并对MAP基因进行RNA干扰,分析了MAPK基因及其他相关基因信号通路的调控机制,主要研究结果如下:(1)利用RACE技术克隆并获得了亚洲玉米螟体内MAPK基因全长cDNA序列。序列全长1592bp,开放阅读框(ORF)长度约1095 bp,ATG为起始密码子,TAA为终止密码子,编码364个氨基酸,包括一个65 bp的5'非编码区和一个432 bp的3'非编码区(GenBank登录号为:MF797866)。Of-MAPK的计算分子量约为41.9kDa。在22-355位含有一个S TKC保守结构域,对Of-MAPK进行蛋白结构预测后发现具有13个α螺旋,8个β折叠。Of-MAPK的氨基酸序列与二化螟Chilo suppressalis ERK2、脐橙螟蛾Amyelois transtella MAPK、海波斯莫科马属蛾Hyposmocoma kahamanoa MAPK、大蜡螟 Galleria mellonella MAPK、柑橘凤蝶Papilio xuthus MAPK、棉铃虫Helicoverpa armigera MAPK 高度同源。(2)采用pET-28a表达系统对MAPK基因编码的蛋白进行了原核表达,结果表明:Of-MAPK重组蛋白的分子量大小与预测结果一致,约为41 kDa。pET-28a-Of-MAPK在28℃、0.2 mMIPTG诱导条件下上清中可大量表达MAPK蛋白,并进行了 Western blotting鉴定。多克隆抗体制备完成后,通过FITC标记可明显在血细胞上观察到MAPK蛋白的分布,利用免疫电镜可在幼虫体壁组织中观察到MAPK蛋白颗粒的分布。(3)亚致死浓度Cry1Ab-LC30处理亚洲玉米螟4龄幼虫后,通过qRT-PCR检测了不同时间MAPK及其他相关基因(AKHR、PPO、GSH-Px、Cat及Hsp90)mRNA水平上的表达变化情况;将MAPK成功RNAi后检测了 MAPK及其他相关基因mRNA水平上的表达变化情况;亚致死浓度Cry1Ab-LC30处理后再将MAP RNAi,并检测MAPK及其他相关基因mRNA水平上的表达变化情况。结果表明:Of-MAPK以及Of-Hsp90基因在表达水平上均显著提高;AHK及GSH-Px处理早期会受到影响而显著升高;PPO及Cat表达会受到抑制。亚洲玉米螟4龄幼虫注射MAPK-dsRNA后,MAPK基因表达从12 h至72 h均有明显下调。当MAPK基因被沉默后,AKHR基因表达水平上调,PPO基因在0-48h内下调,随后表达水平升高,GSH-Px以及Cat基因表达在12-24 h受到抑制,随后显著上调,而Hsp90基因表达则表现出受到持续抑制的效果。将亚洲玉米螟4龄幼虫喂饲活化后的Cry1Ab-LC30后再进行M4PK基因的RNAi,结果发现早期MAPK基因与这些基因之间存在一定的相互关联,MAPK基因正调控PPO、Hsp90、GSH-Px及Cat基因,而MAPK基因负调控AHKR基因。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.132
【部分图文】：

取保存的总ＲＮＡ约２?｜ｉｇ至２００卟ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ灭菌ＰＣＲ管中，然后加入ｄＮＴＰ?Ｍｉｘｔｕｒｅ??（１０?ｍＭ?ｅａｃｈ）?１?ｐＬ，０．５?ｊｉＭ?Ｏｌｉｇｏ?（ｄＴ）?ｐｒｉｍｅｒ?１?｜〇Ｌ，用?ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ?ｄｄＨ２〇?补足至?１０?）ｉＬ，??用枪头混合后，将样品置于６５°Ｃ条件下变性５?ｍｉｎ，放入冰盒中低温冷却ｌＯｍｉｎ。接着按??次序将下列试剂加入上述反应液中：５＞＜ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ?Ｂｕｆｆｅｒ?４?（ｉＬ，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ?ＲＮａｓｅ??（２００Ｕ／ｊａＬ）?１｜ｊＬ，ＲＮａｓｅ?Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ?（４０Ｕ／（ａＬ）?０．５?｜ａｌ，用?ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅｄＨ２〇?补足至?２０?ｐＬ。??将混合物缓慢用枪头混匀，离心后置于４２°Ｃ条件下温育６０?ｍｉｎ，然后升温至７０°Ｃ并持续??１５ｍｉｎ，即可完成ｃＤＮＡ合成。??２．５?基因的?３’－ＲＡＣＥ??２．５．１引物设计??基因中间片段引物设计参照其他鱗翅目昆虫脱４／叹基因的序列进行，扩增??得到的片段确认无误后，在己知亚洲玉米螟中间片段序列设计３’ＲＡＣＥ引物，反应扩增的??原理如下（图１），扩增３＇ＲＡＣＥ目的片段的特异性引物设计见表１。??Ｋｎｏｗｎ?ｓｅｕｅｎｃｅ

末端快速扩增，通过两对不同引物扩增得到的３＇－ＲＡＣＥ产物长度均约为６００?ｂｐ?（图３）。??将目标条带分别进行割胶回收，连接Ｔ载体，转化感受态细胞，筛选摇菌，抽取质粒送测??序。５＇－ＲＡＣＥ通过引物扩增得到３条条带，３条长度约符合预期大小，分别割胶回收（图４），??单克隆挑斑鉴定送测序（３条带测序后鉴定均为但完整度较高）。??ｂｐ?Ｍ?１?２??２０００??？－??１０００??Ｅ?，?＂?■＇??７５０?——??丨歲缓邊錄攀’?＾?：?：：＾?Ｏ／－ＭＡＰＫ??５００????２５０??图３?６？／－Ｍ４Ｐ＾基因３＇ＲＡＣＥ第一轮和第二轮的扩增产物??注：Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；泳道丨：３＇－ＲＡＣＥ?第一轮?ＰＣＲ?扩增产物；泳道?２：?３＇－ＲＡＣＥ?第二轮?ＰＣＲ??扩增产物??

３．１．２?ｑ／ＵＰ／ｉｒ基因全长ｃＤＮＡ序歹ＩＪ的克隆??根据３＇－ＲＡＣＥ和５＇－ＲＡＣＥ克隆获得部分序列，拼接后设计基因全长克隆的引物，进行??的全长克隆实验，得到１５００?ｂｐ左右的扩增产物（图５），通过测序确定０／－Ｍ４／３／：??基因的全长核苷酸序列为１５９２?ｂｐ。??ｂｐ?Ｍ?１??２０００?￣????Ｑ／１ＭＡＰＫ??１０００?■??７５０???５００???２５０???１００???图５?０／－Ｍ４／Ｖｆ全长ｃＤＮＡ扩增产物电泳结果??注：Ｍ：?ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｋｅｒ；泳道１：全长ＰＣＲ扩增产物的电泳结果??
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 周淑香;鲁新;李丽娟;张国红;丁岩;刘宏伟;;不同化性亚洲玉米螟单倍型分析[J];植物保护学报;2012年04期

2 张玉江,丁永楼;亚洲玉米螟为害水稻初步观察[J];中国稻米;1995年03期

3 慕立义;王开运;;亚洲玉米螟对六六六抗药性及取代药剂的研究[J];植物保护学报;1987年03期

4 卿九龄,陈昌兰,王克钰,黄仁军;万县地区亚洲玉米螟的鉴定[J];四川农业学报;1988年02期

5 汪羞德;;亚洲玉米螟对甜玉米产量损失的影响[J];上海农业科技;1988年03期

6 慕立义;王开运;;杀虫剂室内选育亚洲玉米螟抗药性及交互抗性的研究[J];植物保护学报;1988年03期

7 忻亦芬;刘志娴;马绍元;徐文贵;;飞机喷洒Bt及Bt混剂防治亚洲玉米螟试验[J];沈阳农业大学学报;1989年01期

8 翟保平;陈瑞鹿;;亚洲玉米螟飞翔能力的初步研究[J];吉林农业科学;1989年01期

9 方圆;张晨萱;杨峰山;付海燕;;亚洲玉米螟(Osrinia furnacalis)人工饲料研究进展[J];黑龙江科学;2019年20期

10 刘伟;张宇瑶;魏洪义;;汞和砷对亚洲玉米螟生长发育和繁殖的影响[J];华中昆虫研究;2019年00期

相关博士学位论文 前9条

1 王秀平;氧化石墨烯对亚洲玉米螟生长发育的影响及其对杀虫剂增效性能研究[D];中国农业科学院;2019年

2 涂小云;亚洲玉米螟滞育和生物学特性地理变异的研究[D];江西农业大学;2011年

3 张柱亭;亚洲玉米螟对气候变暖的响应及其对温度胁迫的适应机制研究[D];沈阳农业大学;2013年

4 白树雄;转基因抗虫玉米次生代谢物质的变化及对亚洲玉米螟寄生性天敌腰带长体茧蜂的影响[D];中国农业科学院;2011年

5 胡建;腰带长体茧蜂抵御其寄主亚洲玉米螟细胞免疫反应的机理研究[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2003年

6 屈明博;亚洲玉米螟几丁质合酶基因表达与生理功能研究[D];大连理工大学;2012年

7 郭井菲;亚洲玉米螟取食玉米产生的诱导抗性机制研究[D];中国农业科学院;2017年

8 黄丽莉;亚洲玉米螟不同地理种群杂交后代滞育特性与mtDNACOⅠ序列特性的研究[D];江西农业大学;2013年

9 王增霞;Cry1Ac蛋白对腰带长体茧蜂的安全性评价及两者对亚洲玉米螟生理机制的研究[D];中国农业大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 张一强;亚洲玉米螟MAPK基因克隆及其对亚致死浓度生物农药Cry1Ab处理的响应[D];扬州大学;2019年

2 葛亚菲;黑龙江省西部半干旱区亚洲玉米螟发生与绿色防控研究[D];黑龙江八一农垦大学;2019年

3 汤迪;黑龙江巴彦县亚洲玉米螟发生动态和综合防治技术研究[D];东北农业大学;2019年

4 赵雅;Serpin2和βGRP3在亚洲玉米螟免疫识别和防卫过程中的功能研究[D];扬州大学;2018年

5 刘雪微;亚洲玉米螟Bt抗性种群的遗传多样性研究[D];中国农业科学院;2018年

6 侯月敏;亚洲玉米螟哈尔滨种群发生规律与滞育的研究[D];东北农业大学;2018年

7 张宇瑶;汞、砷对亚洲玉米螟生长发育及生殖行为的影响[D];江西农业大学;2018年

8 马丹聃;黑龙江亚洲玉米螟种群分布及GSTs家族基因功能研究[D];黑龙江大学;2018年

9 阿依克孜;新疆荒漠绿洲生态区亚洲玉米螟主要生物学特性及发生世代验证[D];塔里木大学;2018年

10 付军;球孢白僵菌（Beauveria bassiana）对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）产卵选择行为的调控机制[D];东北师范大学;2018年

本文编号：2869837