沈阳三种木本植物病毒病的分子检测与鉴定

发布时间：2020-11-04 08:11

　　 本研究通过透射电镜观察、小RNA深度测序技术和RT-PCR扩增技术对辽宁三种木本植物样品中病毒进行了鉴定。确定侵染桃叶卫矛的病毒为甲型线性病毒科(Alphaflexiviridae)马铃薯X病毒属(Potexvirus)中的一个新病毒;确定侵染黄檗的病毒为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)里新建立的玫瑰黄花叶病毒属(Roymovirus)的新病毒;确定侵染丁香的病毒为乙型线性病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)中水蜡A病毒(ligustrum virus A,LVA)的辽宁分离物。本研究丰富了可感染木本植物的病毒资源,为防治木本植物病毒病奠定了理论基础。(1)2016年8月,在辽宁沈阳采集到患有黄脉症状的桃叶卫矛叶片,使用透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察到750×13nm病毒粒子。通过小RNA深度测序和RT-PCR分子克隆技术,在样品中扩增到一种Potexvirus属病毒。该病毒的基因组由7,279个核苷酸组成,并含有5个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。基于外壳蛋白(Coat protein,CP)基因的核苷酸和氨基酸序列,该病毒与白三叶草花叶病毒(White clover mosaic virus,WCMV,X16636)(40.1%)和三叶草黄花叶病毒(Clover yellow mosaic virus,ClYMV,D00485)(37.1%)具有40%左右的同源性。系统发育分析表明该病毒与Potexvirus属中的草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)的同源性最高,在系统发育树中在同一分支上。上述分析表明,该病毒是甲型线性病毒科(Alphaflexiviridae)马铃薯X病毒属(Potexvirus)中的一个新病毒,将其命名为卫矛黄脉伴随病毒(Euonymus yellow vein associated virus,EuYVAV)。这是第一次桃叶卫矛植物感染马铃薯X病毒的报道。(2)2017年10月,在辽宁沈阳60年树龄的木本植物黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)的黄环斑病叶中观察到弯曲的线性病毒粒子(1000×13nm)。使用小RNA深度测序和RT-PCR分子克隆技术,从病叶中扩增到一种马铃薯Y病毒科(Potyviridae)的病毒。该病毒的完整基因组序列由10,457个核苷酸组成,并且包含一种典型的马铃薯Y病毒科的多聚蛋白(Polyprotein)。经鉴定该病毒与马铃薯Y病毒科(Potyviridae)里新建立的玫瑰黄花叶病毒属(Roymovirus)中的玫瑰黄花叶病毒(Rose yellow mosaic virus,RoYMV,NC_019031)的同源性最高,并且在基于完整多聚蛋白和外壳蛋白基因序列构建的系统发育树中与RoYMV在同一分支上。该病毒的cp基因与RoYMV的核苷酸和氨基酸的同源性分别为49.2%和55.1%,表明该病毒是Potyviridae科的新成员,被命名为黄檗黄环斑伴随病毒(Phellodendron yellow ringspot-associated virus,PYRAV)。这是国内外首次病毒感染黄檗植物的报告。(3)2016年6月,在辽宁省沈阳市采集的表现为黄脉针叶症状的丁香样品中观察到弯曲的线性病毒粒子(580×13nm)。使用小RNA深度测序和RT-PCR分子克隆技术从病叶中扩增到一种乙型线性病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)病毒。该病毒的完整序列大小为8,525nt,并编码六种典型的Carlavirus蛋白。基于该病毒的基因组序列进行同源性分析,发现该病毒与水蜡A病毒的韩国分离物(Ligustrum virus A,LVA)的同源性最高,为73.2%,并且在构建的系统发育树时与LVA在同一分支上。基于复制酶蛋白(ReP)和外壳蛋白(CP)基因,该病毒与LVA的核苷酸序列的同源性分为72.2%和74.9%,氨基酸序列同源性分别为81.4%和86.1%。由此,可以断定该病毒是LVA的分离物。这是首次LVA天然感染丁香植物的报道。
【学位单位】：沈阳大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S432.41
【部分图文】：

无包膜的线性病毒粒子（470-580×13nm组。基因组 RNA 含有 5'-帽子结构和 3'- RNA 聚合酶（RdRp），三种基因（TG5]。虽然近年来已报道了大量的 Potexvir[66-82]。本实验报道了一种能够侵染木本毒。 月采集的桃叶卫矛（Euonymus bungean存于本实验室（图 2.1）。

图 2.2 RT-PCR 扩增桃叶卫矛上 EuYVAV 基因组全长引物设计图Figure 2.2 The design of EuYVAV RT-PCR primer genome cDNA clone on Euonymus bungeanusMaxim2.3 实验方法2.3.1 病毒电镜观察取新鲜的典型花叶症状叶片，置于研钵中，加入 10% PBS 缓冲液至刚好没过叶片，研磨，将样品研磨成匀浆状，置于 1.5ml Eppendorf 管中，室温下5000rpm-6000rpm 离心 3min。吸取液体另放于新管中，取植物病毒粗提液 20μl，2%磷钨酸 50μl 于表面皿上，首先将铜网置于粗提液上表面，为了使样品汁液附着于铜网中，将铜网放入其中漂染 3min，染色 10s，滤纸吸干液体，放置于表面皿中备用；将样品置于透射电镜下（Hitachi TEM system）观察（观察实验

菊 B 病毒 Chrysanthemum vi杨树花叶病毒 Poplar mosaic vi苹果茎痘病毒 Apple stem pitting 湖北甲型线性病毒 Hubei alphaflexi-lik分析叶样品电镜观察结果卫矛病叶于透射电镜下进行病毒粒子的负性粒子，病毒粒子外表面无包膜（图 2.3
【参考文献】

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本文编号：2869858