核受体因子HR3和βFTZ-F1在飞蝗蜕皮发育中的功能研究

发布时间：2020-11-04 23:10

　　 飞蝗(Locusta migratoria)属于昆虫纲,直翅目,蝗科,由于其具有较强的迁飞和跳跃能力,因此其分布范围极广,涉及欧亚大陆和大洋洲以及我国华北和华东沿海各省。飞蝗主要危害小麦、玉米、高粱、水稻等经济作物,是一种极具破坏力的农业害虫,严重威胁农业生产、影响人民的正常生活。飞蝗是一种渐变态昆虫,昆虫的变态发育是伴随着蜕皮发生的,昆虫正常的蜕皮对于其整个生命周期至关重要。昆虫蜕皮受到蜕皮激素(20-Hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(Juvenile hormone,JH)的调节,而激素是通过下游的转录因子发挥作用的,其中主要是核受体因子(nuclear receptor,NR)。核受体因子是一个庞大的家族,广泛参与昆虫的蜕皮、生殖、免疫以及形态建成等过程,因此核受体因子历来是研究热点,同时核受体因子也是害虫防治新的潜在靶标。本文基于飞蝗转录组和基因组数据库获得两个核受体因子:HR3和βFTZ-F1,并探讨其在飞蝗表皮和翅发育中的作用,主要研究结果如下:1.HR3和βFTZ-F1序列和表达特性基于飞蝗转录组和基因组数据库,克隆获得LmHR3和LmβFTZ-F1 cDNA序列,其长度分别为1626 bp和2196 bp,分别编码455和731个氨基酸,均具有典型的核受体保守结构域:DBD(DNA Binding Domain)和LBD(Ligand Binding Domain);聚类分析结果显示二者分别与蜚蠊目的昆虫聚为一支;飞蝗5龄若虫不同组织和时期表达结果显示:LmHR3在测试组织部位均有表达,其中在表皮中的表达量最高,发育时期表达显示,其在第6天表达到达峰值;而LmβFTZ-F1在各组织均高表达,但时期表达显示其在第7天达到峰值。二者时期表达模式与20E滴度具有一致性,二者均在蜕皮前高表达,暗示其可能受20E诱导。随后,体内20E诱导实验和沉默掉20E受体基因EcR两个实验结果,均可表明其受到20E正调控作用。2.LmHR3在飞蝗蜕皮中的功能分析为了探讨LmHR3在飞蝗蜕皮中的功能,首先利用RNA干扰方法向5龄第2天若虫体内注射10μg LmHR3的dsRNA(dsLmHR3),以注射等量的绿色荧光蛋白基因GFP的dsRNA(ds GFP)为对照,正常饲养观察表型。结果显示,沉默LmHR3的表达后5龄若虫全部无法出现蜕皮表型而死亡。HE和几丁质染色结果显示,与对照组相比,处理组若虫表皮能够发生皮层溶离,但新表皮层显著变薄;透射电镜结果显示,新表皮几乎无法正常形成,旧表皮无法降解。RT-qPCR检测几丁质代谢相关基因发现,与对照组相比,几丁质合成(LmUAP1和LmCHS1)和降解(LmCht5和LmCht10)基因的表达均显著降低,表明LmHR3通过调控几丁质代谢相关基因的表达控制若虫向成虫的转变。为了进一步探讨LmHR3在若虫至若虫间蜕皮中的作用,利用同样方法在飞蝗早期若虫(3龄和4龄)中沉默掉LmHR3均导致飞蝗无法正常蜕皮,最终导致死亡;类似于5龄若虫至成虫,早期若虫几丁质代谢相关基因的表达在处理组中均出现显著下调。综上所述LmHR3可通过调控几丁质代谢相关基因的表达来控制飞蝗若虫至若虫和若虫至成虫的蜕皮。3.LmβFTZ-F1在飞蝗蜕皮中的功能分析利用上述RNA干扰方法,向5龄若虫体腔注射LmβFTZ-F1的dsRNA沉默其表达,结果显示,与对照组相比,处理组5龄飞蝗若虫出现一定程度的延迟发育,尽管最终能出现蜕皮变为成虫,但成虫出现身体褶皱,翅型卷曲;通过HE染色观察对照组和处理组5龄若虫翅芽的发育情况,结果显示处理组翅芽皮层溶离延迟;透射电镜结果显示处理组成虫表皮和前翅均可发现真皮细胞层中细胞结构被破坏。同理,在早期若虫(4龄虫)沉默LmβFTZ-F1的表达,发育至成虫后出现与干涉5龄时期若虫类似的表型。为了探讨LmβFTZ-F1在飞蝗蜕皮中的作用机制,我们在5龄第2天飞蝗若虫沉默LmβFTZ-F1表达,48 h后剪取对照组和处理组飞蝗的翅芽提取总RNA进行转录组测序分析。结果共获得19142条Unigenes,177个差异表达基因,其中96个呈上调,81个呈下调;进一步分析发现几丁质代谢相关基因、翅特异表达的表皮蛋白基因和羧肽酶代谢相关基因(与皮层溶离相关)具有表达差异性;RT-qPCR验证结果显示,羧肽酶代谢相关基因表达与对照组相比显著下调,推测LmβFTZ-F1可能参与调控羧肽酶代谢相关基因的表达进而控制飞蝗皮层溶离的发生。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S433.2
【部分图文】：

1图 1.1 昆虫表皮和翅的结构[1, 2]Epicuticle：上表皮，Exocuticle：外表皮，Endocuticle：内表皮，Procuticle：原表皮，Epidermal cells：真皮细胞

分子量约为 51 kDa，LmβFTZ-F1 的理论等电点 pI 是 6.25，分子量约 79 kDa。LmHR3 含有 10 个外显子（图2.1A），结构预测分析显示 LmHR3 含有一个配体结合域 LBD 和一个锌指结构的 DNA结合域 DBD（图 2.1B）；系统发育树分析结果显示 LmHR3 与蜚蠊目湿木白蚁和德国小蠊聚在一支（图 2.1C），LmHR3 氨基酸序列与其他昆虫的氨基酸序列比对发现 LBD

图 2.1 飞蝗的 LmHR3 的生物信息学分析A：显示 LmHR3 的基因结构图，LmHR3 大致的基因长度，Exon 表示外显子，绿色竖线表示；Intron表示内含子，黑色横线表示。B：显示不同物种的 HR3 含有的结构域，黄色椭圆表示 DBD（Zn-FC4），绿色六边形表示 LBD（HOLI），Lm 表示飞蝗、Aa 表示埃及伊蚊、Dm 表示果蝇、Bg 表示德国小蠊，aa=氨基酸。C：采用邻接法与不同物种的聚类分析，Bootstrap 值为 1000，从上往下为 Blattaria蜚蠊目，Orthoptera 直翅目，Hymenoptera 膜翅目，hemiptera 半翅目，Coleoptera 鞘翅目，Diplostraca 双甲目，Diptera 双翅目
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本文编号：2870748