柑橘鳞皮病毒RT-LAMP检测技术研究及其全基因组序列分析

发布时间：2020-11-05 02:59

　　 柑橘是世界上种植最广泛的水果之一,中国是主要的柑橘生产国,面积和产量均居世界第一。柑橘鳞皮病毒(Citrus psorosis virus,CPsV)引起的柑橘鳞皮病是一种世界性分布的病毒类病害,主要通过嫁接进行传播。CPsV是蛇形病毒属典型的种,是三分体负单链RNA病毒。CPsV具有两种类型鳞皮病A和鳞皮病B,其中鳞皮病A比较常见,其引起的典型症状为:嫩叶叶脉间出现褪绿斑纹,主干树皮出现鳞片状开裂;鳞皮病B会引起更严重的症状,嫩叶出现橡形叶症状,老叶出现环斑症状,主干和嫰枝出现鳞片状开裂,但是感染鳞皮病A的柑橘植株可以保护植株在次感染鳞皮病B时,不出现鳞皮病B的症状。目前已经公布了一组CPsV的基因组序列,为西班牙的P-121株系。本研究根据NCBI数据库中CPsV外壳蛋白(Coat protein,CP)的基因序列设计了4组特异性检测引物,通过一系列反应条件的优化,筛选并获得1组特异性的检测引物。以感染CPsV的柑橘叶片总RNA为模板,采用一步法RT-LAMP(One-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification),在60℃下反应60 min,扩增产物利用琼脂糖电泳分析,同时对其特异性和灵敏度进行测定。结果表明,建立的RT-LAMP检测体系能特异性扩增CPsV,灵敏度为RT-PCR的10倍。用建立的RT-LAMP方法对258个田间样品进行检测,发现5个样品感染了CPsV,其检测结果与RT-PCR法一致。RT-LAMP法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、反应快速等特点,适合对CPsV样品的快速检测与鉴定。运用转录组测序、RT-PCR和RACE验证,获得了CPsV的5个分离物CHN-1、CHN-2、CHN-3、CHN-HN和CHN-UN21的全基因组。序列分析结果表明,CHN-1、CHN-2、CHN-3、CHN-HN和CHN-UN21的基因组全长大小分别为11282 nt、11279nt、11278 nt、11283 nt和11305 nt,均包含4个开放阅读框。CHN-1、CHN-2、CHN-3、CHN-HN和CHN-UN21之间的MP基因的核苷酸相似性为80.78%~99.37%,编码氨基酸相似性为90.55%~99.16%;与国外CPsV分离物的MP基因核苷酸序列相似性为80.78%~99.79%,其对应氨基酸序列相似性为89.71%~99.58%。CHN-1、CHN-2、CHN-3、CHN-HN和CHN-UN21之间的CP基因的核苷酸相似性为81.44%~99.02%,编码的氨基酸相似性为88.38%~99.32%;与国外CPsV分离物的CP基因核苷酸序列相似性为81.29%~100.00%,其对应氨基酸序列相似性为88.38%~100.00%。基于MP基因和CP基因的系统进化分析显示CHN-1、CHN-2、CHN-3和CHN-HN聚为一簇,CHN-UN21单独聚为一簇。通过序列分析发现CHN-3和CHN-UN21的序列存在较大差异,由于没有CHN-3和CHN-UN21单独侵染的柑橘苗木,为了验证二者是不是在症状上也存在差异,将CHN-3和CHN-UN21的MP基因24 k基因克隆至表达载体TRV中,侵染本氏烟观察症状差异。结果表明,二者在本氏烟上的侵染症状相似,均表现为叶片出现轻微皱缩症状。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S436.661.1
【部分图文】：

图 1.1 蛇形病毒属包含病毒的病毒粒子形态（A）和基因组结构（B）Fig. 1.1 Virion morphology (A) and genomic structure (B) of the genus Ophiovirus1.1.2 CPsV 的发现与发生由 CPsV 引起的柑橘鳞皮病是一种古老的柑橘病害。19 世纪 90 年代，在佛罗里达州和加利福尼亚首次观察到老叶呈现斑驳黄化症状、树皮呈鳞片状开裂，在当时并不清楚引起该症状的病因。1933 年，Fawcett 发现引起柑橘树嫩叶花叶以及[16-18]

第 1 章 文献综述病 B（psorosis B，PsB）[30]。PsA 是比较常见的 CPsV 感病类型，主要危害宽皮柑橘（Citrus reticulata）、葡萄柚（Citrus paradisi Macf）和甜橙（Citrus sinensis (L.) Osbeck）等敏感寄主，可引起树木主干枝条呈鳞片状开裂，树木主干流胶位点凹陷，并且树杈部位的木质发生变色（图 1.2b），田间感病植株的春梢、秋梢常出现枯萎（图 1.2d）以及叶脉间褪绿黄化及斑驳症状（图 1.2e）。酸橙和柠檬等耐感品种，感染后会表现出典型的叶片症状，而不会出现树皮开裂症状[31, 32]。PsB 会引起比 PsA 更加严重的症状，感病植株会出现嫰枝充胶现象，树皮大面积呈鳞皮状开裂（图 1.2a），嫩叶上出现橡形叶症状（图 1.2f），老叶上出现明显的环斑以及坏死症状（图 1.2g）），同时叶背面出现粘性脓疱（图 1.2h），果实上也会出现明显的环斑以及半环斑现象（图 1.2c）[32-34]。但是 PsB 田间发生率较低。

图 1.3 科西嘉岛上宽皮桔树干去皮前后的柑橘瞎胶病的凹陷症状（A、B）、科西嘉岛橙作砧木的宽皮桔树的柑橘囊胶病的凹陷症状（C、D、G）和接种柑橘鸡冠皮病的酸橙树的凹陷症状（E、F、H）Fig. 1.3 Bind pocket symptoms on mandarin trunk before and after bark remoral, Corsica. (A, Mandarin trees on sour orange with concave gum symptoms on scion, Corsica. (C, D, G);Cristacortis stem pitting on inoculated sour orange seedling trees. (E, F, H)1.4.5 柑橘石果病柑橘石果病由感染该病害的果实像石头一样坚硬而得名。该病首先在巴基被描述为生理性病害[53]。柑橘石果病在地中海地区比较流行[54]，伊朗和委内[55]已证实了该病的存在。感病的柑橘树叶片会出现环斑和橡形叶症状，同时异常的果实下落，以及果皮变硬并伴随皮下冲胶现象（图 1.4）[56]。Ruggier柑橘石果病可进行嫁接传播[57]。
【参考文献】

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本文编号：2871022