马麝是国家Ⅰ级重点保护野生动物,由于被持续的过度捕杀和栖息地缩减等因素,越来越濒危。另一方面,高致病率和死亡率一直是该物种人工驯养的重要障碍。马麝属于反刍动物,肠道微生物对其生存具有很大的意义。肠道中存在的微生物群落是物种长期进化的结果,与动物的食性、机体免疫、营养需求等关系密切。长期的圈养改变马麝的食物搭配,导致肠道微生物的变化,可能降低其免疫力,使其易发疾病。对野外马麝来说,在食物短缺的冬季,如何从高纤维的食物中吸收更多的营养也是其生存的关键。从野外马麝和圈养马麝肠道菌群的差异出发,探讨不同生存状态下两组马麝肠道菌群的群落结构、多样性和菌群功能等方面的差异;挖掘肠道菌群中的优势菌群、差异菌群并对其相关的代谢通路进行分析。通过对两个马麝种群的肠道菌群进行对比研究帮助我们获得宿主的营养吸收、抗生素使用情况、易患疾病等诸多方面信息,进而为该珍稀野生动物的保护及其肠道微生物的研究奠定基础。采用高通量测序的技术,对野外和圈养马麝的肠道菌群分别做16SrRNA测序和宏基因组测序分析。研究结果如下:1.基于16SrRNA测序的野外马麝和圈养马麝冬季肠道菌群结构及差异分析基于16S rRNA测序对肠道微生物进行注释分类,确定了在马麝肠道微生物中丰度最高的10个门。它们在野外马麝(W)和圈养马麝(C)组中的相对丰度分别为:厚壁菌门(Firmicutes:85.27%,59.80%)、拟杆菌门(Bacteroidetes:10.30%,29.23%)、螺旋体门(Spirochaetes:0.11%,2.98%)、变形菌门(Proteobacteria:1.17%,3.14%)、软壁菌门(Tenericutes:1.26%,1.20%)、蓝藻门(Cyanobacteria:0.49%,0.49%)、纤维杆菌门(Fibrobacteres:0.03%,0.30%)、疣微菌门(Verrucomicrobia:0.14%,0.11%)、放线菌门(Actinobacteria:0.61%,0.42%)和广古菌门(Euryarchaeota:0.06%,0.32%)。通过对比发现,两组马麝的肠道菌群在总体结构上相似,厚壁菌门和拟杆菌门均是优势菌门,但在菌种比例上差异显著。作为反映机体营养吸收和能量代谢的重要指标之一,厚壁菌门和拟杆菌门的比例(F/B)在W组显著高于C组(W:8.28,C:2.05)。高比例的厚壁菌种可以帮助机体从食物中吸收更多的营养并造成脂肪沉积。这是野外马麝为适应食物资源贫瘠的冬季而形成的生理机制。马麝肠道菌群中丰度最高的10个属为5-7N15、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、梭菌属(Clostridium)、密螺旋体属(Treponema)、罗氏菌属(Roseburia)、拟杆菌属(Bacteroides)、颤螺菌属(Oscillospira)、Anaerostipes、粪球菌属(Coprococcus)和Dorea。其中在两组马麝中相对丰度差异最大的菌属是密螺旋体属。存在于所有马麝粪便样品中的核心菌有:罗氏菌属、粪球菌属、梭菌属、颤螺菌属、Blautia rc4-4、瘤胃球菌属和5-7N15。除了 5-7N15属于拟杆菌门,其余核心属皆属于厚壁菌门。其中大部分的核心菌属都有产生SCFA(short chain fatty acid;短链脂肪酸)的功能。2.野外和圈养马麝冬季肠道菌群多样性差异分析和显著差异菌种分析通过对野外马麝和圈养马麝的a多样性和β多样性的分析,对两组样品组内和组间各个样品的相似性,样品中所含的细菌的数目、丰度、菌群结构差异和样品多样性的差异做了详细、深入的研究。总体来讲,两组样品存在明显的分离现象,且组间样品差异要比组内样品差异显著。W组内各样品中微生物多样性差异较大,但是总体略低于C组内各样品中微生物多样性。可见,十几年的驯养过程并未显著降低马麝肠道菌群的多样性。通过T-test检验和LEfSe分析组间显著差异菌属发现,两组马麝肠道菌群具有显著差异的菌属在W组中丰度较高的多为厚壁菌门,包括:梭菌属、罗氏菌属、颤螺菌属、Anaerostipes、肠球菌属(Enterococcus)、Dorea、Blautia、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和Faecalibacterium。在C组丰度较高的属多属于拟杆菌门和螺旋体门,其中有:密螺旋体属、5-7N15、瘤胃球菌属、拟杆菌属、Paludibacter、普氏菌属(Prevotella)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、Paraprevotella 和希瓦氏菌属(Shewanella)。3.基于宏基因组测序的野外和圈养马麝冬季肠道菌群功能差异分析基于高通量测序的手段,从代谢通路(KEGG),同源基因簇(eggNOG),碳水化合物酶(CAZy)的功能注释三个方面进行马麝肠道菌群的功能分析。基于KEGG的信号通路,统计了野外和圈养马麝各自独有的酶类反应,其中代表野外马麝独有的酶类反应有:K06045(squalene-hopene/tetraprenyl-beta-curcumene cyclase),K01047(secretory phospholipase A2),K00036(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase),K00832(aromatic-amino-acid transaminase),K00022(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)和K01692(enoyl-CoA hydratase)等。这些酶类主要参与的生物过程包括:萜类化合物和聚酮化合物的代谢,倍半萜类和三萜类生物合成,短链脂肪酸的合成和代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。据此推测,野外马麝肠道菌群中含有高丰度的与产生SCFA相关的细菌,除了为机体供能以外,也帮助它们抵御一些肠道疾病的发生。碳水化合物酶的注释,共有4883个基因注释到37个糖基转移酶家族(GTs),涉及到的主要酶类包括纤维素合酶、几丁质合酶、磷酸二醇酯D-甘露糖基转移酶淀粉葡糖基转移酶、透明质酸合酶和几丁质寡糖合酶等。在所有催化糖类酯化反应的碳水化合物酯酶(CEs)中,马麝宏基因组中丰度最高的为CE4,占该家族注释基因数目的32.9%。CE4和CE9在野外马麝的肠道宏基因组中的基因相对丰度均高于圈养马麝组。这两个水解酶家族的主要酶类包括乙酰木聚糖酯酶、壳多糖脱乙酰酶、壳寡糖脱乙酰酶、甲壳素脱乙酰酶和N-乙酰葡糖胺脱乙酰酶,这些酶类均与消化细菌细胞壁的胞壁质、霉菌细胞壁的几丁质、真菌和植物的细胞壁有关。对比食性研究,可以推测,甲壳素酶在野外马麝肠道宏基因组中的高丰度或与食用较多的真菌有关,这一点也印证了食物和肠道菌群功能的相关性。总体来讲,马麝的肠道菌群是食物、生长环境和自身生理特点综合作用的结果。同样,肠道菌群对宿主的营养吸收和能量代谢也发挥着重要的作用。野外马麝肠道菌群高厚壁菌门的结构特点帮助机体从食物中汲取更多的营养,同时产生大量的SCFA,可帮助机体抵抗炎症。另外,植物代谢产生的二级代谢产物如萜类化合物对机体也有重要的保护作用。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S865.41
【部分图文】：
能快速准确的得到大量生物数据和丰富的微生物研宄信息，从而成为研宄微生物多样性??和群落特征的重要手段。宏基因组测序主要流程是：环境中的基因组ＤＮＡ的提取；宏??基因组文库的构建和筛选；基因活性产物表达。Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ信息分析流程如图１－１。??ａ）宏基因组文库构建??直接克隆环境ＤＮＡ的想法最早由Ｐａｃｅ在１９８５年提出，并于１９９１年被他的科研团??队应用于海洋宏基因组１６Ｓ?ｒＲＮＡ基因的克隆［８２，８３］。后来由ＤｅＬｏｎｇ和同事在１９９６年从??海洋水样品构建整个宏基因组ＤＮＡ的ｆｏｓｍｉｄ载体文库而广为人知［８４］。构建宏基因组文??库的需要对ＤＮＡ的片段浓度、大小和纯度等信息进行验证。因为质量差的ＤＮＡ可能??７??
ＣＵｎｉｑｕｅＴａｇｓ）数目是２４。野外马廢粪便样品的ＵｎｉｑｕｅＴａｇｓ有２条，而圈养马廢类便??样品的ＵｎｉｑｕｅＴａｇｓ有２２条，很明显的是圈养组远大于野外组。没有获得注释信息的??Ｔａｇｓ数目平均为０．６５，可见Ｔａｇｓ的注释比例非常高，均大于９９．９％，具体见图２－１。??Ｉ?Ｔｏｕｌ?４２９６２）?■?Ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ?Ｔａｇｓｉａｖｑ?１）?■?ＯＨＷａｖ＾?１０２７）??■?Ｔａｘｏｎ?Ｔｊ３ｓ＊．ａｖ９．３Ｓ４８２）?Ｕｎｉｑｕｅ?Ｔａｇｗａｖ＾?７４７９１??６００００－１?「１７Ｓ０??Ｉ?．?Ｉ?？?ｅ?ｔ?ｊ?：?？?，?ｌｉｓｏｏ??Ｉ；?：?！?ｆ?；ｉ?：＝?ｉ?，?；?；?ｉ?ｉ?ｉ??；－．ｕ?ｉＪ．ｉ?ｍｉ?ｉ?：?ｉ?ｉ?ｓ?；?ｋ?１?；?ｉｐｓｏ??Ｉ４００００?ｉ?Ｓ?，ｉ?？，?，?ｉ?，?ｆ?｝?．?ｉ．：ｉ?．?ｉ?ｉ?３??！?＝?■?ｉ?｜?：ｈ?；?■??ｚ?（?！?：?■?５?ｃ??！?！?Ｉ?！?：?｜?：?；?ｋ７Ｓ０?Ｉ??卜?２００００?＇??－Ｓ００??〇ｃ、°?ｃ、、＾?＃?Ｃ、ｖ。、Ｊ?ｅ?６?ｄ?ｄ?ｄ?／?／?／?／?／?／?／?夕?／?／?ｆ?／?／?／?＃?Ｐ?ｉ?ｉ?＃?妒。??Ｓａｍｐｌｅ?Ｎａｍｅ??图２－１各样品的ＯＴＵｓ聚类和注释情况统计??Ｆｉｇｕｒｅ２－１?Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ?ａｎｄ?ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ?ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ?ａｂｏｕｔ?ＯＴＵｓ?ｆｏｒ?ｅａｃｈ?ｓａｍｐｌｅ??为了解各分类水平的整体注释情况
?３５??Ｎｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ｓａｍｐｌｅｓ??图２－３物种累积曲线??Ｆｉｇｕｒｅ２－３Ｓｐｅｃｉｅｓ?ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ?ｃｕｒｖｅ??１８??
【参考文献】
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2871074
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