sly-miR482e-3p负调控番茄抗枯萎病的机理

发布时间：2020-11-05 09:31

　　 番茄枯萎病是由镰刀属真菌番茄尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici,Fol)侵染引起,导致植物维管束组织枯萎、植株枯黄、球茎和根腐烂,造成植株生长衰弱直至萎蔫枯死的一种世界性真菌土传病害。植物small RNA(sRNA)是一类长度大约为20-30碱基的具有调节基因表达功能的非编码RNA,通过在转录水平或转录后水平调控其靶基因表达,参与了植物对环境胁迫应答等多种重要的生物学过程。在病原菌侵染条件下,许多相关的植物内源sRNA的表达水平会受到影响,但Fol与番茄互作的具体分子机制尚不清楚。我们的前期研究表明,Fol侵染番茄抗病品系Motelle后,一些番茄内源sRNA的表达水平发生变化,其中Sly-miR482e-3p的表达被抑制,其靶基因在Fol侵染后转录水平都相应上升。在此基础上,本研究(1)检测了不同抗性品系番茄在Fol侵染条件下Sly-miR482e-3p的表达,发现Sly-miR482e-3p在病原菌侵染早期应答;(2)不同组织表达结果表明Sly-miR482e-3p主要在番茄植株茎和叶中表达,;(3)利用CRISPR/Cas9基因敲除技术,在感病品种Moneymaker(MM)中敲除Sly-miR482e-3p,获得转基因纯合植株Line2,Line5和Line6,测序结果表明这些转基因植株分别在靶点1位置缺失2、9、6个碱基;(4)qRT-PCR结果表明Sly-miR482e-3p表达水平极显著下降,且Sly-miR482e-3p的两个NBS-LRR 靶基因的表达水平上升;(5)sly-miR482家族其他成员包括sly-miR482a、sly-miR482b、sly-miR482c、sly-miR482d-3p、sly-miR482d-5p 和 sly-miR482e-5p 的表达不受影响;(6)Fcol侵染条件下,抗性分析结果表明在感病品种Moneymaker中敲除Sly-miR482e-3p导致感病品系对病原菌Fol抗性增加,表明Sly-miR482e-3p参与了番茄抗枯萎病的过程;(7)为了进一步探讨Sly-miR482e-3p通过何种具体机制参与了番茄抗枯萎病的过程,我们构建了 6个转录组(mRNA-seq)文库,MM_H2O、MM_Fol、Line2_H2O、Line2_Fol、Line5_H2O、Line5_Fol。(8)通过测序分析Fol侵染后不同材料在不同处理条件下转录组的差异表达和关键信号通路,结果表明在敲除Sly-miR482e-3p后植物激素乙烯信号转导通路受到调控,且乙烯合成以及信号通路因子相关基因差异表达;(9)qRT-PCR结果表明,Sly-miR482e-3p敲除转基因植株中乙烯合成酶基因LeACO1和LeACS3,乙烯信号通路正调控因子基因EIN2和EIL1,乙烯转录应答效应子基因LeERFl、LeERF4、LeERF5和LeERF9表达水平与野生型相比下调;而乙烯通路负调控因子基因LeETR1、LeETR4、LeETR5、LeCTR2和LeCTR3表达水平在Fol侵染后与野生型相比上调;(10)外源喷洒乙烯前体ACC导致抗病品种Motelle对Fol的侵染变得敏感,表明Sly-miR482e-3p可能通过介导乙烯信号传导机制参与了番茄抗枯萎病过程。综上所述,本研究表明Sly-miR482e-3p以负调控的方式介导乙烯信号通路的方式参与了番茄抗枯萎病的过程,揭示了 Sly-miR482e-3p在番茄与尖孢镰刀菌的互作中的分子机理,同时,为利用分子遗传育种培育新的抗枯萎病品种提供了坚实的理论基础。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S436.412.1
【部分图文】：

比如锌指核酸酶（ＺＦＮｓ）?［３７］［３８］，转录激活因子样效应核酸酶（ＴＡＬＥＮｓ）［３９］以及ＲＮＡ??指导的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ核酸酶基因编辑技术＿４１］。其中，Ｃａｓ９是由小ＲＮＡ引导核酸酶与靶??ＤＮＡ通过碱基配对（图１），设计简单，特异性高，效率高且适合高水平的系统。尤其适用??于对各种细胞类型以及有机体的高通量且相对复杂的基因编辑［４２］［４３】。??

材料与方法??料以及供试菌株??宄采用两个不同的番燕品系：抗病品系Ｍｏｔｅｌｌｅ?（Ｍｏｔ）和感病品系Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ植物病原菌为野生型番痴尖孢嫌刀菌（？ＦＨＯＴｒ／ｗｍｃｕ〔网圆ｆ．?ｓｐ．?？ＦＧＳＣ称为ｆＷ４２８７或者＿仏３４９３６）。尖孢镰刀菌接种在液体培养基中，２８°Ｃ，光荡生长４天待用。??幼苗在２５°Ｃ，１６／８－ｈ亮／暗循环条件下生长两周。从土壤中取出番茄幼苗，用流动??冲洗根，然后在分生孢子浓度为ｌｘｌＯ８／?ｍ丨的凡／溶液中孵育３０分钟。用水处苗作为对照。根据需要决定每种处理使用的幼苗数。然后将所有处理过的番茄含有蛭石的盆中，并置于２５°Ｃ的生长室中２４小时（１６小时光照，８小时黑暗）??质粒??究所采用的两种构建ＣＲＩＳＰＲ载体的质粒ｐＨＳＥ４０１＿ｔｏｍａｔｏＵ６（?ｐＴＸ０４１）和ｐＣＢＣｔ〇ｍａｔ〇Ｕ６?（Ｐ４３）由中国科学院遗传与发育研宄所的李传友课题组提供。??ＩＲＢ?Ｔ－ＤＮＡ?ｒｅｐｅａｔ；?１ＮＱＳ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ］??

法５．２检测Ｓｌｙ－ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ的表达量。??通过ｑＲＴ－ＰＣＲ检测了?Ｆｏ／侵染后不同时间点的两个番莉品种Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ和Ｍｏｔｅｌｌｅ的??Ｓｌｙ－ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ的表达水平，如图１。该结果显示，Ｆｏ／侵染后早期，随着时间增加，Ｓｌｙ－??ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ在感病品种Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ中表达量上调，但在７２?ｈｐｉ略微下调；而在抗病品种??Ｍｏｔｅｌｌｅ中ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ表达量下调，同时在７２ｈｐｉ轻微上调，但是表达量明显低于同处理下??的Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ中的表达量。??２?５????＿?ｗｍｍ?ＭＭ－Ｈ２Ｏ?ＭＭ－Ｆｏ／?Ｍｏｔ－Ｈ２〇?Ｍｏｔ－Ｆｏ／??—２．０?－?＾??Ｏｈ?１２ｈ?３６ｈ?７２ｈ??图１尸〇／侵染后Ｓｌｙ?－ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ在Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ和Ｍｏｔｅｌｌｅ中的表达量。??三次独立实验的平均值，误差线代表ＳＤ。字母表示显着差异（单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）?；Ｐ??＜０．０５）〇??２?Ｓｌｙ－ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ组织特异性表达??ＭｉｃｒｏＲＮＡ在植物的生长发育中起着非常重要的作用。然而，由于不同的调控方法，不??同的ＭｉｃｒｏＲＮＡ在植物不同组织中的表达量也不同。ＭｉｃｒｏＲＮＡ具有细胞特异性和组织特异??性表达的特征［１３５］。研究表明，大豆的ｍｉＲ４８２在大豆的所有组织中都有表达，但它有组织特??异性，在茎中表达最高，其次是花，最后是叶和根［１３６］。本研宄中应答尖孢镰刀菌侵染的??ｍｉＲ４８２家族的Ｓｌｙ－ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ是否具有组织表达特异性还没有报道
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本文编号：2871449