马铃薯E3泛素StPUB17靶标StKH17在晚疫病抗性中的功能研究
发布时间：2020-11-08 10:54
马铃薯(Solanum tuberosum L.)是中国第四大粮食作物,生产过程中会受到多种病虫害的危害,严重影响其产量和品质。其中由卵菌致病疫霉菌(Phytophthora infestans(Mont.)De Bary.)引起的晚疫病是危害最严重的病害。本实验室前期发现马铃薯U-box类E3泛素连接酶StPUB17可以正调控晚疫病的抗性。通过酵母筛库得到一个互作蛋白为StKH17,是一个含有KH-domain的RNA结合蛋白,在本氏烟中初步鉴定是一个抗性负调控因子。本研究旨在通过遗传转化获得超量和干涉StKH17马铃薯转基因植株,验证其在晚疫病抗性中的功能;以StKH17为诱饵通过酵母双杂交筛库筛选与其互作的靶标蛋白;获得稳定表达StKH17和myc融合蛋白转基因株系,为下一步利用Chip-seq技术研究StKH17调控的RNA靶标打下基础。取得的主要研究结果如下:1、构建了StKH17超量表达和RNAi干涉载体,通过遗传转化成功获得了2个超量表达和6个干涉马铃薯株系;晚疫病菌接种鉴定表明,超量表达StKH17降低晚疫病抗性,而干涉StKH17增强晚疫病抗性,即StKH17负调控马铃薯晚疫病的抗性。2、蛋白结构分析表明StKH17具有2个保守的结构域,一个为STAR-domain,另一个为KH-domain。酵母自激活和点对点互作验证表明,StKH17与StPUB17的互作需要STAR-domain,缺失STAR-domain对于酵母自激活效应没有影响;而KH-domain对于酵母自激活效应很重要,但其缺失对于StKH17与StPUB17的互作没有影响。3、以StKH17~(△128-261)为诱饵从酵母文库中筛选到3个候选互作蛋白,一个为StKH17自身,另一个为StKH17-2,还有一个为StKH17-3,酵母点对点互作验证表明StKH17-2和StKH17-3与StKH17~(△128-261)特异互作,而不与StPUB17互作。4、构建了破坏RNA结合能力的StKH17(GDDG)突变体载体,在本氏烟中瞬时表达时,发现其不能促进晚疫病菌的侵染。表明GDDG domain对StKH17发挥功能十分重要。5、构建了StKH17-myc蛋白标签载体并通过马铃薯遗传转化,获得11个转基因株系,Western Blot检测到了3个株系稳定的表达了StKH17和3×myc融合蛋白。本研究初步回答了StPUB17可能是通过降解负调控感病因子StKH17从而实现正调控马铃薯晚疫病抗性的假设。另外本研究结果表明,StKH17可能以复合体的形式调控抗病防卫相关基因的可变剪接从而发挥负调控晚疫病抗性的功能。本研究为构建StPUB17-StKH17-靶标蛋白互作模型,阐明StPUB17在马铃薯晚疫病抗性中的功能和分子机制奠定了良好基础。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.32
【部分图文】：
51.2.2 马铃薯晚疫病垂直抗性和水平抗性在马铃薯抗病机制的研究过程中，人们普遍认为分别存在两种抗性：一种是垂直抗性，又称小种专化抗性，还有一种是水平抗性，根据研究人员的不同背景又可称为数量抗性、田间持久抗性和非小种专化抗性。马铃薯垂直抗性是由植物携带的主效抗性 R 基因提供的，是一种特异的单基因控制并且由于病原菌高度的遗传多样性造成的低持久性抗性，表现为对一个或几个图 1.1 晚疫病菌效应子调控植物免疫示意图（Whisson et al., 2016）Fig 1.1 Schematic of P. infestans effectors regulate in plant immunity（Whisson et al., 2016）
泛素化修饰（Ubiquitination）途径简称为 Ub 途径或泛素/26S 蛋白酶体通路，是一种真核生物特有的、典型的蛋白质翻译后的修饰。真核生物体内绝大多数的蛋白质选择性降解都是由泛素化修饰途径控制和调节的，通过对某些生理代谢途径上关键蛋白质的特异降解，从而直接或间接地调控植物的生长与发育、衰老与死亡、抗病与抗逆等生命代谢过程（Sadanandom, 2012；Yee et al., 2009）。泛素蛋白酶体级联反应的过程：首先泛素激活酶 E1 利用 ATP 提供能量，通过把 Ub 一个 C 末端甘氨酸与 E1 一个保守的半胱氨酸形成巯基酯键结合在一起激活泛素 Ub 形成 E1-Ub 复合体，接下来 E1 被释放，激活的 Ub 与泛素结合酶 E2 通过巯基酯键结合在一起形成 E2-Ub 复合体，接下来 E2 携带着激活的 Ub 与泛素连接酶 E3 形成 E2-Ub-E3-Substate 中间复合体，接下来 E2 上的 Ub 通过与蛋白底物Substrate 形成异肽键的方式不断的结合到蛋白底物 Substrate 上形成多聚 Ub 链。最后被多聚 Ub 链标记的蛋白底物 Substrate 会被 26S 蛋白酶体识别并把 Ub 链拆开形成自由的泛素 Ub，而蛋白底物 Substrate 将被分解为多肽片段（图 1.2）。
辽儆?1300 多个可能编码泛素连接酶的基因（Vierstra, 2009）。近期众多研究显示泛素蛋白酶体降解途径在植物抗病中扮演着重要角色（图1.3）。例如：拟南芥、烟草中 E3 连接酶 RAR1/SGT1 在 R 基因介导的抗病反应起着至关重要的作用(Azevedo et al., 2002)；辣椒 RING 泛素连接酶 CaRING1 瞬时表达能够引起细胞的程序性死亡，在拟南芥上超量表达能够抑制 P.syringaepv 和 H.arabidopsidis 的侵染（Lee et al., 2011）；晚疫病菌效应子 AVR3a 可以与马铃薯 U-box E3 连接酶 CMPG1 互作同时增加其稳定性，在由 INF1 激发的细胞程序性死亡过程当中 CMPG1 发挥核心的作用，效应子 AVR3a 可以改变 E3 连接酶 CMPG1 的功能从而抑制由 INF1 引起的细胞程序性死亡促进了晚疫病菌的侵染（Bos et al.,2010）。水稻 SPL11 基因编码的蛋白也是一个含有 U-box 和 ARM 结构域的 E3 连接酶，它与 SPIN6 互作通过影响 SA 的合成进而影响植物的细胞程序性死亡，还能负调控 PAMPs 引发的信号传导和 PTI 免疫途径（Li et al., 2012; Liu et al., 2012）。拟南芥 PUB12 和 PUB13 也是包含 U-box 和 ARM 结构域的 E3 连接酶，它们的作用底 物 是 LRR 类 受 体 激 酶 FLS2 （ FLAGELLIN-SENSING2 ） ， 在 BAK1（BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1-ASSOCIATEDRECEPTORKINASE1）参与下 PUB12/13 降解 FLS2 从而负调控植物的 PTI 信号途径（Lu et al., 2011; O’Neill,2011）。拟南芥 U-box 类 E3 连接酶 PUB22 可以特异性降解胞外运输复合体中的一个亚基 Exo70B2
【参考文献】
本文编号：2874684
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.32
【部分图文】：
51.2.2 马铃薯晚疫病垂直抗性和水平抗性在马铃薯抗病机制的研究过程中，人们普遍认为分别存在两种抗性：一种是垂直抗性，又称小种专化抗性，还有一种是水平抗性，根据研究人员的不同背景又可称为数量抗性、田间持久抗性和非小种专化抗性。马铃薯垂直抗性是由植物携带的主效抗性 R 基因提供的，是一种特异的单基因控制并且由于病原菌高度的遗传多样性造成的低持久性抗性，表现为对一个或几个图 1.1 晚疫病菌效应子调控植物免疫示意图（Whisson et al., 2016）Fig 1.1 Schematic of P. infestans effectors regulate in plant immunity（Whisson et al., 2016）
泛素化修饰（Ubiquitination）途径简称为 Ub 途径或泛素/26S 蛋白酶体通路，是一种真核生物特有的、典型的蛋白质翻译后的修饰。真核生物体内绝大多数的蛋白质选择性降解都是由泛素化修饰途径控制和调节的，通过对某些生理代谢途径上关键蛋白质的特异降解，从而直接或间接地调控植物的生长与发育、衰老与死亡、抗病与抗逆等生命代谢过程（Sadanandom, 2012；Yee et al., 2009）。泛素蛋白酶体级联反应的过程：首先泛素激活酶 E1 利用 ATP 提供能量，通过把 Ub 一个 C 末端甘氨酸与 E1 一个保守的半胱氨酸形成巯基酯键结合在一起激活泛素 Ub 形成 E1-Ub 复合体，接下来 E1 被释放，激活的 Ub 与泛素结合酶 E2 通过巯基酯键结合在一起形成 E2-Ub 复合体，接下来 E2 携带着激活的 Ub 与泛素连接酶 E3 形成 E2-Ub-E3-Substate 中间复合体，接下来 E2 上的 Ub 通过与蛋白底物Substrate 形成异肽键的方式不断的结合到蛋白底物 Substrate 上形成多聚 Ub 链。最后被多聚 Ub 链标记的蛋白底物 Substrate 会被 26S 蛋白酶体识别并把 Ub 链拆开形成自由的泛素 Ub，而蛋白底物 Substrate 将被分解为多肽片段（图 1.2）。
辽儆?1300 多个可能编码泛素连接酶的基因（Vierstra, 2009）。近期众多研究显示泛素蛋白酶体降解途径在植物抗病中扮演着重要角色（图1.3）。例如：拟南芥、烟草中 E3 连接酶 RAR1/SGT1 在 R 基因介导的抗病反应起着至关重要的作用(Azevedo et al., 2002)；辣椒 RING 泛素连接酶 CaRING1 瞬时表达能够引起细胞的程序性死亡，在拟南芥上超量表达能够抑制 P.syringaepv 和 H.arabidopsidis 的侵染（Lee et al., 2011）；晚疫病菌效应子 AVR3a 可以与马铃薯 U-box E3 连接酶 CMPG1 互作同时增加其稳定性，在由 INF1 激发的细胞程序性死亡过程当中 CMPG1 发挥核心的作用，效应子 AVR3a 可以改变 E3 连接酶 CMPG1 的功能从而抑制由 INF1 引起的细胞程序性死亡促进了晚疫病菌的侵染（Bos et al.,2010）。水稻 SPL11 基因编码的蛋白也是一个含有 U-box 和 ARM 结构域的 E3 连接酶，它与 SPIN6 互作通过影响 SA 的合成进而影响植物的细胞程序性死亡，还能负调控 PAMPs 引发的信号传导和 PTI 免疫途径（Li et al., 2012; Liu et al., 2012）。拟南芥 PUB12 和 PUB13 也是包含 U-box 和 ARM 结构域的 E3 连接酶，它们的作用底 物 是 LRR 类 受 体 激 酶 FLS2 （ FLAGELLIN-SENSING2 ） ， 在 BAK1（BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1-ASSOCIATEDRECEPTORKINASE1）参与下 PUB12/13 降解 FLS2 从而负调控植物的 PTI 信号途径（Lu et al., 2011; O’Neill,2011）。拟南芥 U-box 类 E3 连接酶 PUB22 可以特异性降解胞外运输复合体中的一个亚基 Exo70B2
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
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本文编号：2874684
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