颖壳伯克霍尔德菌基因组分析及水平转移基因的筛选

发布时间：2020-11-14 09:25

　　 水稻细菌性穗枯病是由颖壳伯克霍尔德菌(Burkholderia glumae)引起的一种严重种传病害。B.glumae除了侵染水稻之外,还可侵染人类肺部,在土壤等环境中也广泛存在,因此认为B.glumae具有较强的微环境适应性和致病性。基因水平转移是细菌进化的重要动力,对增强细菌的环境适应性和致病性具有重要作用。本论文基于基因组测序从基因水平转移视角分析了B.glumae的进化特征,以探讨基因水平转移对B.glumae致病性和微环境适应性的影响。首先,完成了第一株中国水稻B.glumae分离株——HN的全基因组图谱。HN菌株的基因组大小为6,584,463bp,由2条染色体和1个质粒构成,共编码7239个基因。致病基因分析显示HN菌株存在39个致病相关基因,这些基因可归为两大类:与水稻细菌性穗枯病相关的毒黄素合成基因簇等21个基因;与人类肺囊性纤维化病相关的苯乙酰-CoA单加氧酶合成基因簇等7个基因。致病基因分析表明HN菌株同时具有侵染水稻和人体的潜力。其次,分析了基因水平转移对B.glumae进化的作用。进化分析显示:不同来源的9个B.glumae菌株分属于4个不同的分支,其中HN菌株和其它菌株进化差异明显,表明B.glumae存在4种不同的进化历程。泛基因组分析显示B.glumae的核心基因组包括3246个基因,泛基因组包括7092个基因,表明B.glumae存在大量的外源基因。采用构建系统发育树的方法,对3株具有完整基因组的水稻分离菌株(HN、BGR1、LMG2196)和1株人体分离菌株AU6208进行了水平转移基因分析,结果从菌株HN、BGR1、LMG2196和AU6208中分别筛选出了 43、41、50和43个水平转移基因。这些水平转移基因包含了 2组基因对:sbnA/sbnB和pehA/pehB和3个分别合成Massetolide A、吡咯喹啉醌和吩嗅的基因簇。其中,除了sbnA/sbn 仅存在于人体致病菌株AU6208中,其余为共有基因。2个水平转移基因对的功能分析。sbnA/sbnB通过一次基因水平转移从链霉菌属转移到AU6208菌株。sbnA和sbnB编码的酶可催化反应产生L-2,3-二氨基丙酸。L-2,3-二氨基丙酸是许多抗生素(如紫霉素和卷曲霉素)的关键前体,也是葡萄球菌铁载体B的前体,铁载体B影响葡萄球菌在哺乳动物血清的正常生长及其致病性。pehA和pehB通过两次独立的早期HGT转移到B.glumae,pehA和PehB编码两种高度相似的聚半乳糖醛酸苷酶。在Burkholderia cepacia中,pehA参与洋葱鳞茎的浸渍反应;在Erwinia carotovora中,pehA基因表达的调节因子和PehA是产生毒力所必需的。可见,两组基因与和细菌的致病性和微环境适应性密切相关。3个水平转移基因簇的功能分析。MassetolideA合成基因簇来源于假单胞菌属,整个基因簇包含13个基因,编码合成一种环脂肽类抗生素,具有广谱抗菌活性;MassetolideA也是Pseudomonas fluorescens群集运动及其生物膜形成的重要因子。吡咯喹啉醌合成基因簇共有5个基因pqqABCDE,其中pqqBE来源于假单胞菌属。吡咯喹啉醌是一种氧化还原辅助因子和抗氧化剂,可提高细胞对活性氧的耐受能力。吩嗪合成基因簇来源于放线菌门,整个基因簇包括7个基因phzBCDEFGI。吩嗪可作为电子穿梭体,促进细菌和植物获取铁和营养物质。此外,吩嗪缺失突变显著减弱Pseudomonas aeruginosa体对小鼠的致病性。可见,3个基因簇也与菌株的致病性和微环境适应性密切相关。综上,基因组分析发现B.glumae通过基因水平转移从其它细菌获得了大量外源基因,这些基因可编码合成次生代谢产物或其前体,可促进生长、提高抗性和毒力,很可能对B.glumae的致病性和微环境适应性具有重要意义,后续将对此进行验证。以上结果对解析B.glumae的进化历程和精准研制高效防治制剂具有指导意义。
【学位单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.111
【部分图文】：

于一致性的方法。??目前研宄者普遍认为构建系统发育树是检测ＨＧＴ的黄金法则ｔ１２５ｌ。目前的??研宄表明ＨＧＴ发生的主要类型一共为６种，如图１．２所示１６１１。尽管绝大多数??ＨＧＴ情况都可以通过构建系统发育树检测，然而一些伴随着大量基因复制以及??丢失现象的ＨＧＴ是很难通过建树检测出来（例如图１．２?ｆ）。??Ｏｒｇａｎｉｓｍａｌ?ｔｒｅｅ?Ｇｅｎｅ?ｔｒｅｅ?Ｏｒｇａｎｉｓｍａｌ?ｔｒｅｅ?Ｇｅｎｅ?ｔｒｅｅ??ａ?——??Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｖｅ?＿?ｉ￣二?一?＾＞—ｉ—?Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｖｅ?，?｜?［?１＝１??ｔｒａｎｓｆｅｒ?「厂一二?＾＇?｜￣ｔｒａｎｓｆｅｒ?ｗｉｔｈ?—?「－（?＿?＾?１￣Ｉ￣￣１＝１??ｊ?Ｉ?［二?Ｉ?Ｉ?ｉ?ｄｉｆｆｓｒｓｎｔｉｓｌ?丨?Ｉ?＾?■?＿?ｊ—￣ｉ?！??１０８５??ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?￣?Ｅ?￣?ｌ－ｒ＾＝??ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ?Ｈ?￣?Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ?ｒ￣Ｃ３＝??ｃ?，?＾?［—??ｒＬｆ－＾?ｒ?ｆ???＾??Ａｎｃｉｅｎｔ???ｉ??ｉ?＾?？—Ｉ￣?？—Ｉ?ｒ—ｉ??ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?￣?「－Ｊ?＾?＊￣￣Ｉ￣￣Ｌ￣ｒ?＾Ｔ￣?一１?＾??ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ?［?￣＿?．￣ｉ?，—?Ｔｒａｎｓｆｅｒ?ｏｆ??—｜?＾，?Ｉ￣￣?ｊ?１?｜—ｉ—?ｎｅｗ?ｇｅｎｅ?士??“？？ｌ．．．：…ｔ：：：：?ｉ????图１．２不同种类的转移及其对基因系统发育的影响ＨＩ??每一棵物种进化树代表了一种假设的进化关系

浙江理工大学硕士学位论文?颖壳伯克霍尔德菌基因组分析及水平转移基因的筛选??菌株的基因组。利用Ｑｕｂｉｔ?２．０焚光计和ＮａｎｏＤｒｏｐ?２０００紫外分光光度计分别对??ＤＮＡ质量进行检测。检测符合标准后，使用Ｎａｎｏｐｏｒｅ测序仪测序，获得原始序??列。??２．２基因组拼接??使用Ｃａｎｕ软件对Ｎａｎｏｐｏｒｅ产生的数据进行拼接，参数默认整个拼接??

浙江理工大学硕士学位论文?颖壳伯克霍尔德菌基因组分析及水平转移基因的筛选??２．４．２构建单拷贝基因进化树??使用自制脚本筛选出核心基因组的单拷贝基因，并按照相同顺序从头到尾依??次连接，使用软件进行同源序列比对，然后使用ＩＱｔｒｅｅ软件构建系统??发育树［１４２］。??３结果与分析??３．１基因组信息分析??３．１．１?ＡＮＩ分析结果??通过将ＨＮ菌株和属１１个不同种的代表菌株进行ＡＮ１分析，??结果如图２．２所示，本图是ＡＮ丨分析的结果，结果显示ＨＮ菌株的基因组和及??ｇ／ｗｍａｅ?ＬＭＧ?２１９６菌株的基因组ＡＮ丨值达到了?９９°／。。一般认为原核物种边界阈??值是９５％，也就是说如果细菌基因组之间的ＡＮＩ值超过９５％，则这两个菌株为??同一个物种。因此认为从湖南省分离得到的致病菌株是ｇ／ｗｗｗ。??
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