根腐病是蓝莓生产当中的重要病害之一,不仅影响着蓝莓的品质和产量,还能够使植物整株死亡,造成严重经济损失。随着蓝莓种植不断向新的地区发展,不同的种植环境、品种布局与种苗来源也关系着病害发生的多样性。本实验室2013年-2017年对我国蓝莓产区病害的调查中发现了两种类型的蓝莓根腐病,分别由丽赤壳属真菌与镰孢属真菌引起,两种类型根腐病的症状类似,均是侵染植株根部,导致叶片及枝条干枯,并最终造成整株死亡。为明确引起蓝莓根腐病的病原菌种类,并为此类病害的防治提供理论基础,本研究结合传统形态学鉴定和分子系统发育种群研究技术,鉴定了分离自蓝莓根部的病原菌,比较了不同病菌的生物学特性,评价了不同蓝莓品种对根腐病菌的抗感差异,集成与研发了蓝莓根腐病菌PCR快速检测技术。研究结果如下:1.经采集分离与鉴定共获得4种蓝莓根腐病菌经采集分离纯化,本研究共获得4株蓝莓根腐病代表菌株,鉴定结果显示菌株HNCS02Bb为木贼镰孢菌Fusarium equiseti,HNCS02Da为F.commune,SDRS02Ba为F.oxysporum,菌株YNQJ01Aa为冬青丽赤壳Calonectria ilicicola。对得到的根腐病病原真菌进行形态特征的观察,镰孢菌各供试菌株菌落形态多样,各菌株均可从大型分生孢子的典型特征判断属于镰孢菌属,对代表菌株在PDA上25℃条件下培养7 d时的特征进行描述:HNCS02Bb菌落白色至粉色,背面肉色至桃色;HNCS02Da菌落正面白色至紫色,背面通常产生紫色色素;SDRS02Ba菌落正面白色至紫色,背面产生紫色色素。分离到的丽赤壳属真菌YNQJ01Aa,在PDA上25℃条件下培养7 d时菌落直径达到90 mm,菌落呈白色至黄色,背面白色至淡黄色,根据分生孢子棍棒型、两端钝圆的特征以及大小鉴定该菌为丽赤壳属真菌。系统发育分析与鉴定:经过ITS序列的BLAST结果分析表明,4株代表菌属级别的分类结果与形态学一致。进行进一步的系统发育研究,丽赤壳属的系统发育研究采用EF-1α,β-tubulin及Histone 3三段基因联合,镰孢菌属采用EF-1α基因构建系统发育树,对4株蓝莓根腐病代表菌株进行进一步的系统发育分析,结合形态学特征鉴定。结果显示,3株镰孢菌代表菌株鉴定结果为HNCS02Bb为木贼镰孢菌Fusarium equiseti(属F.incarnatum-equiseti复合种),HNCS02Da为F.commune,SDRS02Ba为F.oxysporum(属尖孢镰孢菌复合种),丽赤壳属菌株YNQJ01Aa为冬青丽赤壳Calonectria ilicicola,其无性态为寄生帚梗柱孢霉Cylindrocladium parasiticum。同时本实验室还发现了一种由丽赤壳属造成的茎部病害,经鉴定其病原菌为Calonectria canadensis,无性态为Cylindrocladium canadense,该病原菌也用于后续PCR检测试验中的验证。2.4种蓝莓根腐病病原菌的生物学特性存在差异研究了不同氮源、碳源、不同培养基、光照与p H对蓝莓根腐病4株代表菌株菌丝生长的影响,结果显示:F.equiseti菌株HNCS02Bb,F.commune菌株HNCS02Da与F.oxysporum菌株SDRS02Ba在不同碳源培养基上的菌落直径无显著差异,C.ilicicola菌株YNQJ01Aa最适碳源为可溶性淀粉。HNCS02Da的最适氮源为半胱氨酸,HNCS02Bb的最适氮源为半胱氨酸和Na NO3,SDRS02Ba与YNQJ01Aa的最适氮源为Na NO3。4株供试菌株均在PDA,OA和蓝莓汁培养基上菌丝生长良好。HNCS02Da与SDRS02Ba的最适生长温度为25°C-30°C,YNQJ01Aa与HNCS02Bb的最适生长温度为25°C。3种光照条件对供试菌株菌丝生长速率的影响不明显。供试菌株在p H为4-8范围内均能够生长,HNCS02Da在液体培养基中菌丝生长较其他3株供试菌缓慢,HNCS02Bb适宜p H为6,SDRS02Ba最适p H为5,YNQJ01Aa最适p H为4。3.不同蓝莓品种的对4种根腐病病原菌敏感性存在差异选择6个供试品种进行4株供试菌株接种,比较敏感性差异,并选取4株供试菌均能够侵染的‘奥尼尔’品种进行叶片与枝条的接种,比较供试菌株之间致病力的差异。在不同品种的敏感性差异研究中,接种30 d时,菌株HNCS02Bb对供试品种‘埃利奥特’与‘夏普蓝’未表现出致病性,HNCS02Da对全部供试品种有致病性,但是不同品种发病程度不同,供试菌株SDRS02Ba对‘埃利奥特’品种未表现致病性,YNQJ01Aa对‘夏普蓝’品种未表现致病性。菌株YNQJ01Aa除可以侵染蓝莓的根部外,还可侵染叶片与枝条,且发病迅速,3种镰孢菌中HNCS02Bb与HNCS02Da除可以侵染蓝莓的根部外也可以侵染蓝莓叶片与枝条,但致病力较弱,只有SDRS02Ba不具备侵染叶片的能力,只能侵染根部和枝条,对枝条致病性力弱。4.分别设计了C.ilicicola与F.equiseti的种特异性引物,集成了前人发表的F.oxysporum与F.commune种特异性引物本研究鉴定出的4种病原菌中,F.oxysporum与F.commune在PCR检测方面,前人的研究有很多,因此,可采用已报道的引物进行检测。而C.ilicicola与F.equiseti相关研究较少,本文针对这两个种进行了特异性引物的设计与验证,C.illicola特异性引物Cail4F/R基于β-tubulin基因设计,产物片段长度362 bp,F.equiseti特异性引物Feq EF/R基于EF-1α基因,其产物长度200 bp。经验证,两对引物的特异性较好,只能对目标菌扩增出条带,而对非目标的蓝莓根腐病菌种类、蓝莓其他属的病原菌以及寄主植物蓝莓的总DNA不会扩增出条带。引物灵敏度测试结果显示,Cail4F/R可以检测出25μl体系中100 pg的目标真菌DNA,Feq EF/R可以检测出25μl体系中1 ng的目标真菌DNA。对于F.oxysporum与F.commune的特异性检测,本研究应用了前人设计的引物,最终确定引物C1/C2与FO1/FO2灵敏度与特异性较好。4对引物相结合,可实现对蓝莓根部病原菌的检测,其退火温度相近,可以在同一反应条件下扩增。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S436.639
【部分图文】：
Lombard等(2010)基于ACT.,BT,CAL.,HIS3.,ITS,LSU.以及EF-1
11图 1-2 Watanabe 等 (2011) 对 Fusarium 属基于 EF-1α与 RPB2 建立的联合系统发育树Figure 1-2 Phylogenetic tree based on EF-1α and RPB2 of the genus Fusarium by Watanabe et al.(2011)
图 2-1 镰孢菌根腐病症状及 3 株代表菌株菌落形态腐病原始发病症状；B. 病害标本的纵切图；C. 菌株 HNCS02Bb 在 PDA 上；D. 菌株 HNCS02Da 在 PDA 上 25 °C 条件下培养 7 d 的菌落；E. 菌株 SDRS The symptoms of blueberry root rot caused by Fusarium and characterirepresentitive isolates
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本文编号：
2885226
