中国烟草赤星病菌ISSR标记的遗传多样性研究

发布时间：2020-11-18 11:40

　　 烟草赤星病是发生于烟草成熟后期的叶部真菌病害,严重威胁着世界各产烟区的烟叶产量和质量。给我国国民经济也造成了严重的损失。生产上主要以化学药剂防治为主,杀菌剂的长期大量使用,烟草赤星病的抗药性问题日益突出。了解烟草赤星病的病原菌组成和病原菌的遗传基础,可促进对烟草赤星病害的全面认识,为制定有效的赤星病防治措施提供信息。本研究主要对烟草赤星病菌的分离鉴定、遗传多样性、致病力分化以及碳氮源利用进行了系统地分析,主要研究结果如下:1.2014~2016年间于我国重庆等9个省市的烟草生产区采集典型的烟草赤星病样品(300份),通过单孢分离共获得289株赤星病菌。从各省市随机挑选15株共135株进行了系统的形态学鉴定,发现其中有70株链格孢菌Alternaria alternata和65株长柄链格孢菌A.longipes;采用引物ITS1和ITS4对135株病原菌进行PCR扩增,并构建系统发育树,供试菌株均与NCBI下载的小孢子种链格孢聚为一组,而与大孢子种链格孢各聚为一组,表明供试菌株为链格孢属小孢子种,ITS序列可作为鉴定烟草赤星病菌的辅助技术。2.采用正交试验设计方法对影响ISSR-PCR反应的主要因子Mg~(2+),dNTP,Taq DNA聚合酶和引物4个因素进行了优化试验,并进行梯度PCR试验确定最适退火温度和循环次数,且验证稳定性,建立了赤星病菌的ISSR-PCR最佳反应体系。在25μL总反应体系中含1.00 mmol/L Mg~(2+),0.15 mmol/L dNTP,0.30μmol/L引物,0.75 U Taq DNA聚合酶,1×PCR Buffer和30.00 ng DAN模板。扩增程序为94℃预变性4 min,94℃变性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸90 s,共36个循环,最后72℃延伸10 min。从40条初筛引物中,筛选出扩增条带清晰、多态性及稳定性较好的17条ISSR引物。3.17条引物分别对135株烟草赤星病菌的基因组DNA进行ISSR-PCR扩增,共扩增出192条谱带,其中多态性谱带177条,多态率为92.19%,扩增片段的大小介于100~3000 bp。UPGMA聚类分析显示,链格孢菌和长柄链格孢菌的遗传相似性系数分别在0.67~1.00和0.66~1.00之间,遗传相似系数为0.83可使链格孢菌和长柄链格孢菌分别划分为5个和6个亚群,其中链格孢菌的不同地理种群间表现出一定的地理相关性,长柄链格孢菌的不同菌株随机分组。PopGene分析显示,病菌种群的基因多态性和遗传多样性丰富,链格孢菌和长柄链格孢菌的群体间遗传分化系数(G_(ST))分别为0.36和0.37,均存在遗传分化,两种赤星病菌的遗传分化结构表现出相似性;群居每代迁移数(Nm)分别为0.89和0.85,不同地理种群间存在基因交流。表明链格孢菌和长柄链格孢菌均存在丰富的遗传多样性,且二者进化方向相似,ISSR标记能较好地揭示烟草赤星病菌种群之间的亲缘关系和遗传差异性。4.采用菌丝块创伤接种法,测定了135株赤星病菌对云烟87离体叶片的致病力,链格孢菌和长柄链格孢菌的致病力均可分为强、较强、中等、弱和无致病力5个类型,都以致病力较强和致病力中等两个类型的分布比例较高,致病力强、致病力弱和无致病力分布较少且均衡。两种病原菌,其中致病力较强类型的最高分布比率出现在链格孢菌中,占38.6%,而致病力强类型的分布比例最高是长柄链格孢菌,占10.8%。不同省市的菌株在5个致病力类型中分布差异较大,表明我国烟草赤星病菌致病力分化差异明显。5.采用全自动微生物鉴定系统分析2株链格孢菌CQ1(中等致病力)和GZ11(中等致病力)及2株长柄链格孢菌HuN2(强致病力)和YN4(弱致病力)对PM1、PM2中190种碳源物质以及PM3中95种氮源物质的利用情况,结果显示,4株赤星病菌对3个微孔板中碳氮源物质利用总体一致,碳源利用率约为24.21%,氮源利用率约86.31%。不同致病力菌株的利用也表现出差异,长柄链格孢菌的强致病力菌株HuN2比弱致病力菌株YN6对D-甘露糖、D-木糖、D-甘露醇、b-环糊精L-缬氨酸、D-天门冬酰胺、腺苷和i-赤藓糖醇等物质利用更好;链格孢菌的中等致病力菌株CQ1比GZ11对L-鼠李糖、海带多糖和二羟基丙酮利用更好;且弱致病力菌株YN4对水杨苷的利用比强致病力菌株HuN2和中等致病力菌株CQ1、GZ11都好。表明烟草赤星病菌种群内个体间对碳氮源物质的利用上存在差异,从表型上证实我国烟草赤星病菌丰富的遗传多样性。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.72
【部分图文】：

第 2 章 烟草赤星病菌的分离、纯化和鉴定的发病情况及发病症状。发现烟草赤星病主要发生在烟株叶部，烟株打顶后，下部叶片进入成熟阶段后开始发病，逐渐向上发展。发病初期，叶片上的病斑是较小的黄褐色斑点，逐渐扩大成圆形或不规则形的深褐色病斑，边缘明显，直径约1~2 cm，周围常有黄色晕圈，具多重同心轮纹。湿度大时，病斑可以扩大为 1~2.5cm，分生孢子和分生孢子梗在上面形成深褐色或黑色茸毛状的霉层。严重时，产生深黑色或黑色的圆形或椭圆形凹陷病斑，多个病斑能相互连接合并再枯焦脱落，造成整个叶片破碎（图 2-2）。

图 2-2 不同发病时期的烟草赤星病症状Fig. 2-2 The symptoms of tobacco brown spot at different incidence time注：A：发病初期症状；B：发病中期症状；C：湿度大时发病症状；D：病害严重时症状。Note: A: In the early stage; B: In the middle stage; C: In high humidity environment; D: Symptom is severe.2.2 烟草赤星病菌的致病性测定把分离到的菌株接种健康烟叶后，所有菌株均能使其发病，发病初期的症状为褐色斑点，后逐渐扩展成为较规则褐色斑块，边缘多有黄色晕圈，接种 5~7 d 后病斑逐渐变成深褐色或黑色，与田间发病症状很相似。致病性测定后，用离体烟叶上的病斑再次分离病原菌，获得的二次分离菌株和接种物在形态上均一致，符合柯赫氏法则（Koch’s rule）中致病菌鉴定的要求。从而确定接种菌株是引起烟草赤星病的病原菌。2.3 烟草赤星病菌的形态鉴定2015 ~ 2017 年间从重庆等 9 个省市的烟草生产区采集烟草赤星病斑典型 300份，分离纯化并经致病性检测后获得 289 份烟草赤星病原菌（表 2-1），从各省市

贵州 Guizhou GZ 23 27.28oN, 105.29oE四川 Sichuan SC 25 26.58oN, 101.71oE湖南 Hunan HuN 28 29.45oN, 109.44oE重庆 Chongqing CQ 92 29.43oN, 106.91oE云南 Yunnan YN 19 25.04oN, 101.52oE吉林 Jilin JL 31 42.28oN, 125.74oE广西 Guangxi GX 38 25.46oN, 107.23oE河南 Henan HeN 17 34.62oN, 112.45oE湖北 Hubei HuB 16 32.62oN, 110.79oE总计 Total 2892.3.1 链格孢 Alternaria alternata (Fr.: Fr.) Keissler 的鉴定A. alternata 菌株在 PCA 培养基上培养 5 d 后，再在无菌条件下刮下菌丝置于同样条件下培养 2 d，形成的分生孢子链呈多重分枝矮树状，支链一般由 1~5 个孢子组成，淡褐色至褐色的分生孢子单生或短链生，具 3~8 个横隔膜和 1~4 个纵、斜隔膜。淡褐色的短喙呈柱状，部分短喙可以转变为产孢细胞，也称假喙。卵形分生孢子一般 10~30 × 5~12 μm；卵圆形分生孢子一般 25~35 × 4~9 μm（图 2-3）。
【参考文献】

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本文编号：2888675