菜青虫饥饿条件下中肠转录组分析及丝氨酸蛋白酶类基因克隆与表达分析

发布时间：2020-11-18 13:56

　　 菜青虫(Pieris rapae)属鳞翅目粉蝶科,嗜食十字花科的白菜、甘蓝、油菜、萝卜、花椰菜等蔬菜,是危害严重的农业害虫之一。中肠作为昆虫消化器官的主要部位,能分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等多种消化酶参与消化食物,而营养物质吸收是机体进行其他生命活动的基础。因此,若我们了解菜青虫食物消化机制,找到其中的关键消化酶,就能通过阻断其物质吸收来控制虫害。本文利用高通量测序技术、分子生物学等方法研究菜青虫受饥饿胁迫时转录谱变化,并挖掘消化相关基因;同时选取2个丝氨酸蛋白酶候选基因进行克隆、组织表达和异源表达研究。这些研究为进一步探索菜青虫食物消化吸收机制和可能抗虫靶点提供理论基础。主要结果如下:1.对菜青虫正常和饥饿两种状态中肠样本进行转录组测序,共获得的17.82Gb的数据,51544条Unigene。经NR、Swiss-Prot、Pfam、GO、COG、KOG和KEGG数据库同源注释发现,共有22233条Unigene获得注释信息。对比两个转录组,共获得2682个差异表达基因,其中有1610个基因下调,1072个基因上调,有56个是高表达的差异表达基因。将差异表达基因经NR、GO、COG、KOG、KEGG、Pfam和Swiss-Prot数据库功能注释发现,在菜青虫受到饥饿胁迫时,其物质代谢活动、能量代谢活动、酶合成及信号转导等受到明显影响。2.基于中肠作为菜青虫食物消化的主要场所,选择对其表达的消化相关基因进行挖掘,结果发现菜青虫中肠中表达了80个丝氨酸蛋白酶,10个淀粉酶,42个脂肪酶,34个羧肽酶,未发现纤维素酶,其食物中纤维素可能依靠菜青虫肠道菌进行消化。其中,在菜青虫受到饥饿胁迫时,差异表达的淀粉酶和羧肽酶全部下调,而丝氨酸蛋白酶和脂肪酶大部分下调,少部分上调,可能是为了减小体内的能量消耗且保持机体基本活动,对食物消化相关基因进行了调控。3.对菜青虫中肠转录组密码子使用偏好性进行分析,为后续研究提供理论基础。结果发现,菜青虫中肠密码子使用整体偏好性程度不高,但不同基因之间存在明显密码子使用偏好性;菜青虫中肠表达基因偏好以A/U结尾的密码子,GAA,UUU,AAU,UAU 4个密码子为其最优密码子;菜青虫中肠表达的丝氨酸蛋白酶(胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶)在6种不同宿主中表达难度从大到小分别为:大肠杆菌B昆虫High5细胞/哺乳动物HEK293S细胞烟草/毕赤酵母/拟南芥。4.克隆了一个胰凝乳蛋白酶基因PrCT1,该基因编码区由861核苷酸组成,编码286个氨基酸,含有典型的丝氨酸蛋白酶催化三联体(H_(57),D_(102)与S_(195)),经丝氨酸蛋白酶底物特异性口袋的分析显示属于胰凝乳蛋白酶。它与黑脉金斑蝶(GenBank登录号:OWR53227)胰凝乳蛋白酶的同源性最高,达到49%,且亲缘关系最近。利用qRT-PCR检测PrCT1基因在菜青虫中转录发现,它主要在菜青虫中肠表达,且饥饿与决明胰蛋白酶抑制剂喂食处理后表达水平均下调,推测其可能是菜青虫中肠中发挥食物消化作用的重要蛋白酶,且可能是重要的抗虫靶点。将PrCT1基因插入到原核表达载体pET28a,转化Rosseta(DE3)进行原核表达发现,PrCT1重组蛋白以包涵体形式表达;将PrCT1基因插入到真核表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母进行真核表达发现,PrCT1基因能在毕赤酵母中转录,但仅在胞内检测到非常低的目的蛋白表达。5.克隆了一个胰蛋白酶基因PrT1,该基因编码区由1206核苷酸组成,编码401个氨基酸,含有典型的丝氨酸蛋白酶催化三联体(H_(57),D_(102)与S_(195)),经丝氨酸蛋白酶底物特异性口袋的分析显示属于胰蛋白酶。它与脐橙螟(GenBank登录号:XP_013191840)和蜡螟(GenBank登录号:AXY94763)丝氨酸蛋白酶同源性最高,分别为61.32%、59.19%,且亲缘关系最近。将PrT1基因插入到原核表达载体pET28a,转化Rosseta(DE3)进行原核表达发现,PrT1重组蛋白也以包涵体形式表达。再将PrT1重组蛋白皮下注射新西兰兔制备多克隆抗体,经Western Blot检测抗体特异性较好。利用qRT-PCR和Western Blot检测PrT1在菜青虫不同组织部位表达发现,qRT-PCR和Western Blot检测结果基本一致,PrT1主要在菜青虫中肠表达,其他部位(头、尾、脂肪体)表达量非常低,同时在菜青虫受到饥饿胁迫时,PrT1在菜青虫中肠表达水平显著升高。因此,我们推测胰蛋白酶PrT1可能在菜青虫中肠参与食物消化,但其具体功能还需后续进一步研究才能了解。
【学位单位】：西南交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S433.4
【部分图文】：

度：样品浓度在250μg/μL以上，且总量大于30μg；整性：28S与18S亮度比大于等于1.5，且无拖尾现象。转录组测序百迈克生物科技有限公司确认 RNA 样品合格后，采用 Illumina HiSe量测序平台对菜青虫两个样本进行转录组测序。转录组序列组装当时没有菜青虫基因组，经质量过滤的转录组测序数据采用 Trinity 软因组的从头合并组装（de novo assembly）。Trinity 软件首先将 Readser 打断来成小片段，然后选择频率最高的 K-mer 作为种子向两端进行tig，再利用 Contig 聚簇得到 Component，并构建 De Bruijn 图，最后ead 解开 De Bruijn 图，获得转录本序列（图 2-1）。组装完整后评估转确保后续转录组分析结果可靠。

图 2-2 菜青虫中肠 RNA 琼脂电泳序数据统计结果0 高通量测序技术对菜青虫正常和饥转录组数据 17.82Gb，每个样品 Q20续数据分析的准确性，将转录组测序录组分别获得 28,918,396 和 30,791,6表 2-2 样品测序数据统计表正常 28,918,396 19,807,564 68.49% 93.14% 47.48%

图 2-3 组装 Unigene 长度分布4 转录组序列功能注释 Unigene 序列比对到 NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG 数据233 条 Unigene 获得注释信息。其中 NR 数据库共注释 18814 条 Unigen与黑脉金斑蝶（Danaus plexippus）（6665，35.50%）和家蚕（Bombyx4，24.42%）有最大同源性；GO 数据库共注释 10725 条 Unigene，其中大类别分子功能、细胞组分和生物学数目分别为 13635（23.50%）、1744%）、27320（47.0%），而细胞组分中注释最多的前 3个分别为细胞（cell）（%）、细胞组分（cell part）（3539，33.00%）、细胞器（2513，23.43%），释最多前 3 个是催化活性（catalytic activity）（5536，51.62%）、结合（b4，49.55%）、转运活性（transporter activity）(802,7.48%)，生物学过程 3 个是代谢过程（metabolic process（）6686，62.34%）、细胞过程（cellular
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 汪一兵;;急诊左半结肠切除一期吻合术中肠腔内置管的应用——附10例报告[J];工企医刊;1998年06期

2 郭锡杰;;DNV感染蚕中肠若干物质代谢的变化[J];国外农学-蚕业;1988年03期

3 沈发荣,杨大荣,李朝达,杨跃雄,董大志;白马蝠蛾Hepialus baimaensis Linag消化系统的解剖[J];动物学研究;1989年03期

4 龚舒聪;孙远挺;盛思佳;章犇;鲁兴萌;;家蚕微孢子虫感染家蚕对其中肠和血液蛋白酶活性影响[J];蚕桑通报;2008年03期

5 杉田英夫;堀江保宏;殷正夫;;家蚕中肠的糖的吸收部位[J];国外农学-蚕业;1984年04期

6 朱羽凡;唐士元;;检测蚊虫中肠感染病毒的简易方法[J];医学动物防制;1991年02期

7 李美;汤林华;;按蚊中肠细菌及其应用的研究进展[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2010年05期

8 陆雪芳;;一、关於家蚕幼虫消化器官的局部机能差的研究(Ⅵ)中肠皮膜细胞对病毒增殖的感受性及其局部差一[J];广东蚕丝通讯;1964年03期

9 陈毅彪;李婷;郑春琴;郝向伟;韦转琴;向仲怀;鲁成;崔红娟;;家蚕中肠上皮细胞增殖和分化的初步研究[J];蚕业科学;2013年04期

10 尹姣;冯红林;李克斌;曹雅忠;;寄主植物对草地螟中肠解毒酶及保护性酶活性的影响[J];植物保护;2012年01期

相关博士学位论文 前10条

1 潘李隆;中肠在烟粉虱传播木尔坦棉花曲叶病毒中的作用及其机制[D];浙江大学;2017年

2 闸雯俊;利用RNAi技术沉默褐飞虱中肠基因的研究[D];武汉大学;2012年

3 夏晓峰;小菜蛾中肠微生物多样性及其功能研究[D];福建农林大学;2014年

4 吴萍;家蚕感染质型多角体病毒差异表达基因研究[D];中国农业科学院;2010年

5 Myint Myint Khaing;中肠微生物多样性在棉铃虫对Bt Cry1Ac敏感性中的作用[D];中国农业科学院;2017年

6 张卫;黑斑息肉综合征临床诊治与相关基因表达研究[D];第二军医大学;2001年

7 赵丹;暗黑鳃金龟幼虫中肠蛋白基因的分离及表达分析[D];河北农业大学;2014年

8 刘美德;白纹伊蚊和致倦库蚊对登革2型病毒中肠感染屏障与病毒受体关系的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年

9 胡翠美;家蚕肠道免疫相关分子的鉴定及功能研究[D];西南大学;2015年

10 姚慧鹏;家蚕中肠和培养细胞的蛋白质组学研究[D];浙江大学;2009年

相关硕士学位论文 前10条

1 张娴;菜青虫饥饿条件下中肠转录组分析及丝氨酸蛋白酶类基因克隆与表达分析[D];西南交通大学;2019年

2 李引;5种常见果树害虫中肠蛋白酶活性的研究[D];西北农林科技大学;2019年

3 耿亮;烟粉虱带毒前后中肠基因表达分析及与病毒互作的烟粉虱蛋白筛选[D];浙江大学;2017年

4 李强;四种食物对二点委夜蛾中肠消化酶活性的影响与中肠蛋白质组学研究[D];山东农业大学;2017年

5 刘春蕾;不同糖源饲料对越冬蜜蜂肠道健康及肠道微生物区系的影响[D];山东农业大学;2017年

6 陆改;家蚕中肠特异启动子的克隆和鉴定[D];西南大学;2012年

7 杨婷;蜕皮激素通过上调自噬相关基因12的表达来促进中肠程序性细胞死亡[D];山东大学;2016年

8 贾慧茹;亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂中肠菌群的影响[D];中国农业科学院;2015年

9 杨亚;褐黄血蜱HSP70基因克隆与表达分析及中肠微生物构成研究[D];湖南农业大学;2015年

10 李杰;棉铃虫中肠靶标蛋白的分离与鉴定[D];河北农业大学;2010年

本文编号：2888792