玉米大斑病菌StHog1对转录因子StMsn2的调控作用及StMsn2下游靶基因的筛选与验证
发布时间：2020-12-14 19:05
本课题组在前期研究中利用农杆菌介导的转化技术获得了玉米大斑病菌StHOG1基因的敲除突变体（ΔStHOG1）。通过分析ΔStHOG1菌株,发现StHOG1基因参与调控病菌的高渗胁迫反应,并推测StMsn2可能为StHog1下游的一个关键转录因子,其活性受StHog1磷酸化调节,但其具体的分子机制尚不清楚。本研究拟在前期研究基础上以ΔStHOG1菌株为材料,分析StMSN2在转录及其蛋白表达水平来明确StHog1对StMsn2的调控;利用染色体免疫共沉淀（ChIP）、电泳迁移率变动分析（EMSA）及双荧光报告系统筛选并验证转录因子StMsn2下游所调控靶的基因。因此,本研究不仅明确转录因子StMsn2与StHog1的调控关系及StMsn2下游所调控靶的基因,也对进一步完善HOG-MAPK信号通路对调节玉米大斑病菌高渗胁迫反应的分子机制具有重要意义。主要结果如下:1.StMSN2的cDNA序列包含一个长度为1617 bp的开放阅读框（ORF）及编码的蛋白具有两个保守锌指结构域（ZnF-C2H2）,分别位于N末端氨基酸的第418441和447469...
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
1 引言
1.1 玉米大斑病及其病原菌的生物学特征
1.2 病原真菌中的MAPK级联途径
1.3 植物病原真菌Msn2 类转录因子的研究进展
1.4 本研究的目的和意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 宿主菌株
2.1.2 试验载体
2.1.3 植物材料
2.1.4 各种酶及试剂
2.1.5 主要仪器设备
2.1.6 培养基
2.1.7 引物
2.2 试验试剂的配制
2.2.1 SDS-PAGE
2.2.2 Western blot
2.2.3 His融合蛋白的表达纯化
2.2.4 染色质免疫共沉淀ChIP
2.2.5 凝胶迁移EMSA
2.2.6 双荧光报告系统
2.3 试验方法
2.3.1 StMsn2 多克隆抗体的制备
2.3.2 ChIP富集StMsn2 特异性结合的DNA片段
2.3.3 ChIP-qPCR验证富集的DNA片段
2.3.4 RT-qPCR检测基因的转录水平
2.3.5 目的基因的克隆
2.3.6 StMsn2-His融合蛋白的诱导表达
2.3.7 StMsn2-His融合蛋白的纯化
2.3.8 Western blot
2.3.9 EMSA检测目的蛋白与探针的结合
2.3.10 烟草系统检测转录因子对下游基因的调控
2.3.11 玉米大斑病菌全蛋白的提取
2.3.12 蛋白质的去磷酸化处理
2.3.13 StMSN2 的生物信息学分析
3 结果与分析
3.1 St MSN2 基因保守结构域及系统发育分析
3.2 StMsn2 多克隆抗体的制备及鉴定
3.3 StHog1对StMSN2 基因的调控作用
3.3.1 高渗胁迫条件下WT中 StHOG1和StMSN2 的转录水平分析
3.3.2 ΔStHOG1 菌株中StMsn2 的转录水平分析
3.3.3 ΔStHOG1 菌株中StMsn2 的表达水平分析
3.3.4 高渗胁迫下StMsn2 的磷酸化分析
3.4 ChIP技术对StMsn2 下游靶基因的筛选及验证
3.4.1 ChIP富集StMsn2 结合的DNA片段
3.4.2 StMsn2 下游靶基因的筛选
3.4.3 ChIP-qPCR验证StMsn2 下游调控的靶基因
3.5 EMSA在体外对StMsn2 下游靶基因的验证
3.5.1 StMSN2 基因原核表达载体的构建
3.5.2 StMsn2-His融合蛋白的诱导表达
3.5.3 StMsn2-His融合蛋白的纯化
3.5.4 StMsn2-His融合蛋白的western blot验证
3.5.5 EMSA体外验证StMsn2 下游所调控的靶基因
3.6 烟草系统检测转录因子对下游基因的调控
4 讨论
4.1 真菌中Hog1对Msn2 的调控关系
4.2 ChIP技术对靶基因的筛选及验证
4.3 EMSA 在体外验证蛋白对 DNA 的调控
4.4 双荧光素酶报告系统验证蛋白与靶基因的调控关系
5 结论
参考文献
在校期间发表的论文
作者简历
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]2015年辽源市玉米大斑病发生情况及原因分析[J]. 李海悦,刘春玲. 吉林农业. 2019(01)
[2]解淀粉芽孢杆菌gfj-4发酵上清液及与化学杀菌剂混配对玉米大斑病病菌的抑制作用[J]. 段海明,程红,李林玉,余利,黄伟东,余海兵. 华南农业大学学报. 2018(05)
[3]甘油-3-磷酸酰基转移酶在植物脂质代谢、生长及逆境反应中的作用[J]. 陈文玲,张晴晴,唐韶华,龚伟,洪月云. 植物生理学报. 2018(05)
[4]病原真菌中MAPK信号通路的研究进展[J]. 刘帅,陈晨. 湖南农业科学. 2017(11)
[5]植物病原真菌中MAPK级联通路研究进展[J]. 彭静静. 江苏农业科学. 2014(09)
[6]染色质免疫共沉淀-测序（ChIP-Seq）技术及数据分析方法介绍[J]. 杨薇,刘若水. 河南科学. 2014(08)
[7]玉米大斑病菌MAPK超家族的全基因组鉴定及途径模型建立[J]. 巩校东,张晓玉,田兰,王星懿,李坡,张盼,王玥,范永山,韩建民,谷守芹,董金皋. 中国农业科学. 2014(09)
[8]Research Progress on Northern Leaf Blight in Corn[J]. ZHAO Yingnan, and WANG Zhenhua College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China. Journal of Northeast Agricultural University(English Edition). 2009(02)
[9]MAPK途径对玉米大斑病菌HT-毒素产生和生物学活性的调控作用[J]. 范永山,谷守芹,董金皋,董娜. 中国农业科学. 2008(01)
[10]玉米纹枯病研究进展[J]. 赵茂俊,张志明,李晚忱,潘光堂. 植物保护. 2006(01)
博士论文
[1]禾谷镰刀菌组蛋白乙酰转移酶（HATs）和泛素化相关基因FgUbx5的功能研究[D]. 孔祥久.中国农业科学院 2018
[2]玉米胚乳特异表达的Dof类转录因子ZmESDP的功能研究[D]. 齐鑫.中国农业大学 2016
硕士论文
[1]玉米大斑病菌Homeobox基因家族的全基因组鉴定与转录因子StStel2的关系研究[D]. 王玥.河北农业大学 2015
[2]稻瘟病菌转录因子MoMSN2和MoMYB1的生物学功能研究[D]. 赵倩.南京农业大学 2010
本文编号：2916867
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
1 引言
1.1 玉米大斑病及其病原菌的生物学特征
1.2 病原真菌中的MAPK级联途径
1.3 植物病原真菌Msn2 类转录因子的研究进展
1.4 本研究的目的和意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 宿主菌株
2.1.2 试验载体
2.1.3 植物材料
2.1.4 各种酶及试剂
2.1.5 主要仪器设备
2.1.6 培养基
2.1.7 引物
2.2 试验试剂的配制
2.2.1 SDS-PAGE
2.2.2 Western blot
2.2.3 His融合蛋白的表达纯化
2.2.4 染色质免疫共沉淀ChIP
2.2.5 凝胶迁移EMSA
2.2.6 双荧光报告系统
2.3 试验方法
2.3.1 StMsn2 多克隆抗体的制备
2.3.2 ChIP富集StMsn2 特异性结合的DNA片段
2.3.3 ChIP-qPCR验证富集的DNA片段
2.3.4 RT-qPCR检测基因的转录水平
2.3.5 目的基因的克隆
2.3.6 StMsn2-His融合蛋白的诱导表达
2.3.7 StMsn2-His融合蛋白的纯化
2.3.8 Western blot
2.3.9 EMSA检测目的蛋白与探针的结合
2.3.10 烟草系统检测转录因子对下游基因的调控
2.3.11 玉米大斑病菌全蛋白的提取
2.3.12 蛋白质的去磷酸化处理
2.3.13 StMSN2 的生物信息学分析
3 结果与分析
3.1 St MSN2 基因保守结构域及系统发育分析
3.2 StMsn2 多克隆抗体的制备及鉴定
3.3 StHog1对StMSN2 基因的调控作用
3.3.1 高渗胁迫条件下WT中 StHOG1和StMSN2 的转录水平分析
3.3.2 ΔStHOG1 菌株中StMsn2 的转录水平分析
3.3.3 ΔStHOG1 菌株中StMsn2 的表达水平分析
3.3.4 高渗胁迫下StMsn2 的磷酸化分析
3.4 ChIP技术对StMsn2 下游靶基因的筛选及验证
3.4.1 ChIP富集StMsn2 结合的DNA片段
3.4.2 StMsn2 下游靶基因的筛选
3.4.3 ChIP-qPCR验证StMsn2 下游调控的靶基因
3.5 EMSA在体外对StMsn2 下游靶基因的验证
3.5.1 StMSN2 基因原核表达载体的构建
3.5.2 StMsn2-His融合蛋白的诱导表达
3.5.3 StMsn2-His融合蛋白的纯化
3.5.4 StMsn2-His融合蛋白的western blot验证
3.5.5 EMSA体外验证StMsn2 下游所调控的靶基因
3.6 烟草系统检测转录因子对下游基因的调控
4 讨论
4.1 真菌中Hog1对Msn2 的调控关系
4.2 ChIP技术对靶基因的筛选及验证
4.3 EMSA 在体外验证蛋白对 DNA 的调控
4.4 双荧光素酶报告系统验证蛋白与靶基因的调控关系
5 结论
参考文献
在校期间发表的论文
作者简历
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]2015年辽源市玉米大斑病发生情况及原因分析[J]. 李海悦,刘春玲. 吉林农业. 2019(01)
[2]解淀粉芽孢杆菌gfj-4发酵上清液及与化学杀菌剂混配对玉米大斑病病菌的抑制作用[J]. 段海明,程红,李林玉,余利,黄伟东,余海兵. 华南农业大学学报. 2018(05)
[3]甘油-3-磷酸酰基转移酶在植物脂质代谢、生长及逆境反应中的作用[J]. 陈文玲,张晴晴,唐韶华,龚伟,洪月云. 植物生理学报. 2018(05)
[4]病原真菌中MAPK信号通路的研究进展[J]. 刘帅,陈晨. 湖南农业科学. 2017(11)
[5]植物病原真菌中MAPK级联通路研究进展[J]. 彭静静. 江苏农业科学. 2014(09)
[6]染色质免疫共沉淀-测序（ChIP-Seq）技术及数据分析方法介绍[J]. 杨薇,刘若水. 河南科学. 2014(08)
[7]玉米大斑病菌MAPK超家族的全基因组鉴定及途径模型建立[J]. 巩校东,张晓玉,田兰,王星懿,李坡,张盼,王玥,范永山,韩建民,谷守芹,董金皋. 中国农业科学. 2014(09)
[8]Research Progress on Northern Leaf Blight in Corn[J]. ZHAO Yingnan, and WANG Zhenhua College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China. Journal of Northeast Agricultural University(English Edition). 2009(02)
[9]MAPK途径对玉米大斑病菌HT-毒素产生和生物学活性的调控作用[J]. 范永山,谷守芹,董金皋,董娜. 中国农业科学. 2008(01)
[10]玉米纹枯病研究进展[J]. 赵茂俊,张志明,李晚忱,潘光堂. 植物保护. 2006(01)
博士论文
[1]禾谷镰刀菌组蛋白乙酰转移酶（HATs）和泛素化相关基因FgUbx5的功能研究[D]. 孔祥久.中国农业科学院 2018
[2]玉米胚乳特异表达的Dof类转录因子ZmESDP的功能研究[D]. 齐鑫.中国农业大学 2016
硕士论文
[1]玉米大斑病菌Homeobox基因家族的全基因组鉴定与转录因子StStel2的关系研究[D]. 王玥.河北农业大学 2015
[2]稻瘟病菌转录因子MoMSN2和MoMYB1的生物学功能研究[D]. 赵倩.南京农业大学 2010
本文编号：2916867
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