受落叶松-杨栅锈菌侵染的川杨novel miRNA靶基因克隆及功能研究
发布时间：2020-12-26 22:39
杨树是世界范围内具有重要的经济和生态价值的树种之一,也是林木遗传的模式树种。由落叶松-杨栅锈菌（Melampsora larici-populina）引起的叶锈病是杨树苗期和幼树阶段的重要叶部病害,常造成杨树生产上很大的损失。microRNA（miRNA）是一类长2025 nt的小分子单链非编码RNA,植物中的miRNA主要通过miRNA与序列互补来切割靶mRNA,从而介导靶mRNA的降解以抑制靶基因的表达,进而参与植物生长发育与逆境胁迫响应。研究miRNA有助于揭示很多生命现象的分子机理,并有助于作物和林木的遗传改良。本论文通过对前期miRNA高通量测序中预测出的与抗锈病相关的两个novel miRNAs进行检测,并对其靶基因进行切割验证、全长扩增以及基因功能预测,构建miRNA前体基因的过表达载体,以便通过根癌农杆菌介导法转入杨树体内,从而深入了解杨树受病原菌侵染时miRNA的功能。具体研究结果如下:1.受落叶松-杨栅锈菌侵染的川杨novel miRNAs检测实验室前期构建了非亲和与亲和性杨树-栅锈菌互作条件下的杨树sRNA文库,本试验从高通量测序得到nove...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 杨树叶锈病概述
1.1.1 杨树叶锈病的发生与危害
1.1.2 落叶松-杨栅锈菌
1.1.3 杨树对落叶松-杨栅锈菌的抗性
1.2 miRNA概述
1.2.1 植物miRNA的起源与产生
1.2.2 植物miRNA的作用机制
1.3 植物miRNA对胁迫的响应
1.3.1 植物miRNA对非生物胁迫的响应
1.3.2 植物miRNA对生物胁迫的响应
1.4 植物miRNA靶标基因的研究
1.4.1 靶标基因的预测
1.4.2 靶基因的验证
1.5 杨树miRNA研究进展
1.6 本研究的目的与意义
第二章 novel miRNA检测及靶基因切割验证
2.1 材料、试剂和仪器
2.1.1 试验材料
2.1.2 试验试剂和仪器
2.1.3 试剂配制
2.2 试验方法
2.2.1 川杨接种
2.2.2 总RNA提取
2.2.3 cDNA第一条链的合成
mir11和novelmir357 的检测"> 2.2.4 novelmir11和novelmir357 的检测
2.2.5 RLM-5’RACE验证novel miRNA对其靶基因的切割
2.3 结果与分析
2.3.1 总RNA质量检测
2.3.2 锈菌接种后反应型观察
mir11和novelmir357 检测结果"> 2.3.3 novelmir11和novelmir357 检测结果
2.3.4 RLM-5’RACE验证novel miRNA对其靶基因的切割
2.4 讨论
第三章 靶基因的全长克隆和表达分析
3.1 材料、试剂与仪器
3.1.1 试验材料
3.1.2 试剂与仪器
3.2 试验方法
3.2.1 中间片段的PCR扩增
3.2.2 RACE-Ready cDNA合成
3.2.3 RACE扩增3’和5’端
3.2.4 PCR产物切胶回收
3.2.5 RACE产物的In-Fusion克隆
3.2.6 全长的拼接和序列结构分析
3.2.7 基因编码蛋白的结构分析
3.2.8 侵染不同菌系后不同时间段novel miRNAs与靶基因的表达检测
3.3 结果与分析
3.3.1 中间片段的扩增及克隆
3.3.2 5 ’和3’端扩增
3.3.3 靶基因全长的获得与分析
3.3.4 基因的生物信息学分析
3.3.5 系统发育树构建
3.3.6 novel miRNA与靶基因表达检测
3.4 讨论
第四章 pze-miR11 前体基因的表达载体构建
4.1 材料、试剂与仪器
4.1.1 试验材料
4.1.2 试验试剂
4.1.3 试验仪器与设备
4.2 试验方法
4.2.1 川杨基因组DNA的提取
mir11 前体基因的克隆"> 4.2.2 川杨novelmir11 前体基因的克隆
4.2.3 表达载体的构建
4.2.4 重组质粒转化根癌农杆菌
4.3 结果与分析
4.3.1 基因组DNA的提取和前体基因的扩增
4.3.2 前体基因序列的比对与二级结构分析
4.3.3 质粒提取和双酶切
4.3.4 重组载体的验证
4.3.5 根癌农杆菌转化的PCR验证
4.4 讨论
第五章 结论
附录
参考文献
致谢
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]果树miRNAs研究进展[J]. 沈妍秋,梁东,吕秀兰,王进,夏惠. 果树学报. 2019(02)
[2]杨树miRNA调控生长发育及逆境胁迫的研究进展[J]. 王丛鹏,唐贤丰,徐华,黄非,周功克,柴国华. 植物生理学报. 2018(12)
[3]gma-miR1507a生物信息学分析、植物表达载体的构建及遗传转化[J]. 马玲,崔晓霞,黄颜众,赵晋铭,王海棠,郭娜,邢邯. 中国细胞生物学学报. 2017(07)
[4]MicroRNA转录后调控欧美杨R2R3-MYBs抗锈菌表达[J]. 李丹蕾,张瑞芝,王峰,陈俏丽,牛春阳,零雅茗,郝昕. 林业科学研究. 2017(02)
[5]植物miRNA靶基因验证研究进展[J]. 何炫程,吕鹤书,黄捷飞,马兰青,杨明峰. 生物技术进展. 2017(02)
[6]杨树转基因研究进展及展望[J]. 丁莉萍,王宏芝,魏建华. 林业科学研究. 2016(01)
[7]毛白杨真菌胁迫下miRNA靶基因预测和生物信息分析[J]. 廖维华,陈仲,叶梅霞,马焕弟,高凯,雷炳琪,安新民. 中国细胞生物学学报. 2014(11)
[8]miR482介导的植物生物胁迫响应[J]. 肖裕,栾雨时. 植物生理学报. 2014(06)
[9]毛白杨12种microRNAs的低温胁迫差异表达分析[J]. 张译云,任媛媛,陈磊,徐吉臣,张志毅,王延伟. 中国农学通报. 2012(07)
[10]植物MicroRNA研究进展及其在植物与病原菌互作中的作用[J]. 耿锐梅,杨宏伟,曹长代,冯全福,陈志强,罗成刚. 浙江农业科学. 2011(05)
博士论文
[1]‘金冠’苹果miRNA克隆分析及Md-miRLn11靶向调控Md-NBS基因表达影响斑点落叶病抗性研究[D]. 马超.中国农业大学 2013
硕士论文
[1]毛白杨低温胁迫相关microRNAs的鉴定及差异表达分析[D]. 张译云.北京林业大学 2012
本文编号：2940567
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 杨树叶锈病概述
1.1.1 杨树叶锈病的发生与危害
1.1.2 落叶松-杨栅锈菌
1.1.3 杨树对落叶松-杨栅锈菌的抗性
1.2 miRNA概述
1.2.1 植物miRNA的起源与产生
1.2.2 植物miRNA的作用机制
1.3 植物miRNA对胁迫的响应
1.3.1 植物miRNA对非生物胁迫的响应
1.3.2 植物miRNA对生物胁迫的响应
1.4 植物miRNA靶标基因的研究
1.4.1 靶标基因的预测
1.4.2 靶基因的验证
1.5 杨树miRNA研究进展
1.6 本研究的目的与意义
第二章 novel miRNA检测及靶基因切割验证
2.1 材料、试剂和仪器
2.1.1 试验材料
2.1.2 试验试剂和仪器
2.1.3 试剂配制
2.2 试验方法
2.2.1 川杨接种
2.2.2 总RNA提取
2.2.3 cDNA第一条链的合成
mir11和novelmir357 的检测"> 2.2.4 novelmir11和novelmir357 的检测
2.2.5 RLM-5’RACE验证novel miRNA对其靶基因的切割
2.3 结果与分析
2.3.1 总RNA质量检测
2.3.2 锈菌接种后反应型观察
mir11和novelmir357 检测结果"> 2.3.3 novelmir11和novelmir357 检测结果
2.3.4 RLM-5’RACE验证novel miRNA对其靶基因的切割
2.4 讨论
第三章 靶基因的全长克隆和表达分析
3.1 材料、试剂与仪器
3.1.1 试验材料
3.1.2 试剂与仪器
3.2 试验方法
3.2.1 中间片段的PCR扩增
3.2.2 RACE-Ready cDNA合成
3.2.3 RACE扩增3’和5’端
3.2.4 PCR产物切胶回收
3.2.5 RACE产物的In-Fusion克隆
3.2.6 全长的拼接和序列结构分析
3.2.7 基因编码蛋白的结构分析
3.2.8 侵染不同菌系后不同时间段novel miRNAs与靶基因的表达检测
3.3 结果与分析
3.3.1 中间片段的扩增及克隆
3.3.2 5 ’和3’端扩增
3.3.3 靶基因全长的获得与分析
3.3.4 基因的生物信息学分析
3.3.5 系统发育树构建
3.3.6 novel miRNA与靶基因表达检测
3.4 讨论
第四章 pze-miR11 前体基因的表达载体构建
4.1 材料、试剂与仪器
4.1.1 试验材料
4.1.2 试验试剂
4.1.3 试验仪器与设备
4.2 试验方法
4.2.1 川杨基因组DNA的提取
mir11 前体基因的克隆"> 4.2.2 川杨novelmir11 前体基因的克隆
4.2.3 表达载体的构建
4.2.4 重组质粒转化根癌农杆菌
4.3 结果与分析
4.3.1 基因组DNA的提取和前体基因的扩增
4.3.2 前体基因序列的比对与二级结构分析
4.3.3 质粒提取和双酶切
4.3.4 重组载体的验证
4.3.5 根癌农杆菌转化的PCR验证
4.4 讨论
第五章 结论
附录
参考文献
致谢
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]果树miRNAs研究进展[J]. 沈妍秋,梁东,吕秀兰,王进,夏惠. 果树学报. 2019(02)
[2]杨树miRNA调控生长发育及逆境胁迫的研究进展[J]. 王丛鹏,唐贤丰,徐华,黄非,周功克,柴国华. 植物生理学报. 2018(12)
[3]gma-miR1507a生物信息学分析、植物表达载体的构建及遗传转化[J]. 马玲,崔晓霞,黄颜众,赵晋铭,王海棠,郭娜,邢邯. 中国细胞生物学学报. 2017(07)
[4]MicroRNA转录后调控欧美杨R2R3-MYBs抗锈菌表达[J]. 李丹蕾,张瑞芝,王峰,陈俏丽,牛春阳,零雅茗,郝昕. 林业科学研究. 2017(02)
[5]植物miRNA靶基因验证研究进展[J]. 何炫程,吕鹤书,黄捷飞,马兰青,杨明峰. 生物技术进展. 2017(02)
[6]杨树转基因研究进展及展望[J]. 丁莉萍,王宏芝,魏建华. 林业科学研究. 2016(01)
[7]毛白杨真菌胁迫下miRNA靶基因预测和生物信息分析[J]. 廖维华,陈仲,叶梅霞,马焕弟,高凯,雷炳琪,安新民. 中国细胞生物学学报. 2014(11)
[8]miR482介导的植物生物胁迫响应[J]. 肖裕,栾雨时. 植物生理学报. 2014(06)
[9]毛白杨12种microRNAs的低温胁迫差异表达分析[J]. 张译云,任媛媛,陈磊,徐吉臣,张志毅,王延伟. 中国农学通报. 2012(07)
[10]植物MicroRNA研究进展及其在植物与病原菌互作中的作用[J]. 耿锐梅,杨宏伟,曹长代,冯全福,陈志强,罗成刚. 浙江农业科学. 2011(05)
博士论文
[1]‘金冠’苹果miRNA克隆分析及Md-miRLn11靶向调控Md-NBS基因表达影响斑点落叶病抗性研究[D]. 马超.中国农业大学 2013
硕士论文
[1]毛白杨低温胁迫相关microRNAs的鉴定及差异表达分析[D]. 张译云.北京林业大学 2012
本文编号：2940567
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