棉花黄萎病防治技术及两个抗病相关基因功能研究
发布时间：2021-03-29 05:37
棉花不仅是我国人民衣着和纺织工业的主要原料,还是出口创汇的重要产品,关系国计民生,意义重大。而棉花黄萎病广泛分布于世界五大洲的各产棉区,严重威胁着棉花的可持续生产。黄萎病菌可通过突变、异核现象等引起变异,土壤、种子、病残体、棉籽壳和棉籽饼等都可作其传播途径,这使其防治较为困难。目前,通过分子手段进行抗病育种是防治该病害的理想措施。本研究制订了棉花黄萎病的田间防治技术并在田间实验基地对该技术进行了防治效果鉴定;以抗黄萎病品种中植棉KV-3作为植物材料,以强致病力菌株大丽轮枝菌V991作为接种病菌,筛选抗黄萎病相关基因;利用RACE和电子克隆等技术得到抗病基因全长;通过亚细胞定位技术和超表达技术分析目的基因的定位及功能。取得结果如下:1.以不采取任何措施和只使用生防制剂拌种作对照,研究棉花黄萎病田间防治技术的防效。实验结果显示,采用生防制剂拌种、施加有机肥、喷施叶面肥和控制早铃相结合的措施,具有防病增产效果。2.利用VIGS技术在中植棉KV-3中成功沉默了基因GhFLS2、GhMRH1、GhAGD13和GhWRKY29,对沉默植株进行抗病性测定发现,GhFLS2、GhMRH1、GhAGD1...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
田间棉花黄萎病症状（简桂良摄）
农业科学院硕士学位论文 第三章 VIGS 技术鉴定抗黄萎病相关分别摘取野生型、转空载体 pCLCrV(A+B)、pCLCrV-GhAGD13 和 pCLCrV-GhWRKY29 叶菌水冲洗干净后放入小烧杯中；向烧杯中加入苔盼蓝染色液，用沸水煮 8-10 分钟染色；液，用水合三氯乙醛溶液（2.5g/mL）脱色；完成脱色后，观察并拍照留存。3. 实验结果.1. 沉默载体的构建沉默载体 pCLCrVA 中所插入的目标基因的大小会直接影响到目标基因的沉默效率，如段过长会妨碍病毒沉默载体在植物中的移动，Burch-Smith 等（2004）通过研究报道，中的插入片段在 300bp 到 500bp 之间效果最好。在本研究中，目标基因的片段均在这个图 3-1 A）；目的片段连接中间载体后，通过双酶切获得了目的基因片段（图 3-1 B）；的基因片段，连接载体后用菌落 PCR 筛选（图 3-1 C），酶切验证 VIGS 载体（图 3-1 D农杆菌后，菌落 PCR 鉴定（图 3-1 E）。A. B.
中国农业科学院硕士学位论文 第三章 VIGS 技术鉴定抗黄萎病相关基因1-4:GhFLS2(352 bp); 5-8: GhMRH1(342 bp); 9-12: GhAGD13(412 bp); 13-16: GhWRKY29(310 bp). B: Intermediate vector enzymedigestion M: 200 bp marker 1-3: GhFLS2; 4-6: GhAGD13; 7-9: GhMRH1; 10-12: GhWRKY29. C: Silent vector colony PCR M: 20bp marker 1-6: GhFLS2; 7-11: GhAGD13; 12-15: GhMRH1; 16-19: GhWRKY29. D: Silent vector enzyme digestion verification M: 20bp marker 1: GhFLS2; 2: GhMRH1; 3: GhAGD13; 4: GhWRKY29. E:Agrobacterium colony PCR M: 200 bp marker 1-4: GhMRH5-8: GhWRKY29; 9-14: GhAGD13; 15-21: GhFLS2.3.3.2. VIGS 技术沉默 GhCLAIGhCLAI 是棉花叶绿素合成过程中所需要的关键基因，缺少该基因棉株会出现白化症状。研究使用子叶注射的方法将 pCLCrVA-GhCLAI-pCLCrVB 注射接种棉株后，约 20 天左右该处的棉株新生叶片首先出现白化的现象，之后整个棉株逐渐白化，而野生型对照和接种空载pCLCrV（A+B）的棉株正常生长且未曾出现白化现象，说明该病毒沉默载体 pCLCrV（A+B）以成功沉默掉目标基因且对棉株的正常生长无影响（图 3-2）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]拟南芥转录因子基因WRKY72的特性分析及其抗逆功能鉴定[J]. 李琪,李烨,牛芳芳,郭小华,赵新杰,吴相民,杨博,江元清. 农业生物技术学报. 2019(02)
[2]AcCBF1转录因子沉默对低温胁迫下扁桃花器官的影响[J]. 宋恬,李鹏,田嘉,刘梦婕,张琦,李疆. 经济林研究. 2019(01)
[3]葛枣猕猴桃果糖激酶基因电子克隆和生物信息学分析[J]. 任伟超,李阳,郝锟,张巍,许忠海,马伟. 中国药师. 2019(01)
[4]玉米ZmRINO1基因盐碱逆境胁迫下的表达及生物信息学分析[J]. 吕庆雪,何欢,高嵩,牛铭晨,孙蕾,李毅丹,张建新,王敏,宋广树,刘文国. 分子植物育种. 2019(19)
[5]钙依赖性蛋白激酶34在小麦籽粒淀粉合成的功能[J]. 徐梦军,高天,王鹏飞,李鸽子,康国章. 中国农业科技导报. 2019(02)
[6]LeETR4沉默对番茄果实成熟的影响[J]. 张策,谢远红,朱本忠. 食品科技. 2018(11)
[7]棉花GhTGA1与GhTGA9.2基因克隆及表达特征分析[J]. 赵曾强,李潇玲,张析,张薇,练文明. 华北农学报. 2018(05)
[8]棉花ERF-B3亚组转录因子基因GhERF5-1的克隆及表达[J]. 郭文婷,张鹏飞,李潇玲,张析,张薇. 江苏农业科学. 2018(19)
[9]VIGS诱导SL-ZH22基因沉默下番茄耐盐性研究[J]. 李景富,张晓春,姜景彬,杨欢欢,赵婷婷,许向阳. 东北农业大学学报. 2018(10)
[10]水稻OsLecRK基因的亚细胞定位分析[J]. 闸雯俊,杨芳,张艳茗,游艾青. 湖北农业科学. 2018(17)
博士论文
[1]利用VIGS技术研究棉花抗逆基因功能[D]. 李芳军.中国农业大学 2014
[2]陆地棉抗黄萎病相关基因筛选及功能验证[D]. 张文蔚.中国农业科学院 2013
硕士论文
[1]GhMAPK和GhMAPKK在棉花应答链格孢抗性中的作用[D]. 高环.中国农业科学院 2018
[2]VIGS技术解析陆地棉抗黄萎病相关基因及GhB2功能初步鉴定[D]. 张华崇.中国农业科学院 2016
[3]棉花抗黄萎病相关基因GhSKIP35基因的克隆与功能验证[D]. 刘凯.中国农业科学院 2015
[4]大丽轮枝菌病程相关基因的筛选及棉花GbEDS1基因的克隆和功能初探[D]. 齐希梁.中国农业科学院 2013
本文编号：3107008
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
田间棉花黄萎病症状（简桂良摄）
农业科学院硕士学位论文 第三章 VIGS 技术鉴定抗黄萎病相关分别摘取野生型、转空载体 pCLCrV(A+B)、pCLCrV-GhAGD13 和 pCLCrV-GhWRKY29 叶菌水冲洗干净后放入小烧杯中；向烧杯中加入苔盼蓝染色液，用沸水煮 8-10 分钟染色；液，用水合三氯乙醛溶液（2.5g/mL）脱色；完成脱色后，观察并拍照留存。3. 实验结果.1. 沉默载体的构建沉默载体 pCLCrVA 中所插入的目标基因的大小会直接影响到目标基因的沉默效率，如段过长会妨碍病毒沉默载体在植物中的移动，Burch-Smith 等（2004）通过研究报道，中的插入片段在 300bp 到 500bp 之间效果最好。在本研究中，目标基因的片段均在这个图 3-1 A）；目的片段连接中间载体后，通过双酶切获得了目的基因片段（图 3-1 B）；的基因片段，连接载体后用菌落 PCR 筛选（图 3-1 C），酶切验证 VIGS 载体（图 3-1 D农杆菌后，菌落 PCR 鉴定（图 3-1 E）。A. B.
中国农业科学院硕士学位论文 第三章 VIGS 技术鉴定抗黄萎病相关基因1-4:GhFLS2(352 bp); 5-8: GhMRH1(342 bp); 9-12: GhAGD13(412 bp); 13-16: GhWRKY29(310 bp). B: Intermediate vector enzymedigestion M: 200 bp marker 1-3: GhFLS2; 4-6: GhAGD13; 7-9: GhMRH1; 10-12: GhWRKY29. C: Silent vector colony PCR M: 20bp marker 1-6: GhFLS2; 7-11: GhAGD13; 12-15: GhMRH1; 16-19: GhWRKY29. D: Silent vector enzyme digestion verification M: 20bp marker 1: GhFLS2; 2: GhMRH1; 3: GhAGD13; 4: GhWRKY29. E:Agrobacterium colony PCR M: 200 bp marker 1-4: GhMRH5-8: GhWRKY29; 9-14: GhAGD13; 15-21: GhFLS2.3.3.2. VIGS 技术沉默 GhCLAIGhCLAI 是棉花叶绿素合成过程中所需要的关键基因，缺少该基因棉株会出现白化症状。研究使用子叶注射的方法将 pCLCrVA-GhCLAI-pCLCrVB 注射接种棉株后，约 20 天左右该处的棉株新生叶片首先出现白化的现象，之后整个棉株逐渐白化，而野生型对照和接种空载pCLCrV（A+B）的棉株正常生长且未曾出现白化现象，说明该病毒沉默载体 pCLCrV（A+B）以成功沉默掉目标基因且对棉株的正常生长无影响（图 3-2）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]拟南芥转录因子基因WRKY72的特性分析及其抗逆功能鉴定[J]. 李琪,李烨,牛芳芳,郭小华,赵新杰,吴相民,杨博,江元清. 农业生物技术学报. 2019(02)
[2]AcCBF1转录因子沉默对低温胁迫下扁桃花器官的影响[J]. 宋恬,李鹏,田嘉,刘梦婕,张琦,李疆. 经济林研究. 2019(01)
[3]葛枣猕猴桃果糖激酶基因电子克隆和生物信息学分析[J]. 任伟超,李阳,郝锟,张巍,许忠海,马伟. 中国药师. 2019(01)
[4]玉米ZmRINO1基因盐碱逆境胁迫下的表达及生物信息学分析[J]. 吕庆雪,何欢,高嵩,牛铭晨,孙蕾,李毅丹,张建新,王敏,宋广树,刘文国. 分子植物育种. 2019(19)
[5]钙依赖性蛋白激酶34在小麦籽粒淀粉合成的功能[J]. 徐梦军,高天,王鹏飞,李鸽子,康国章. 中国农业科技导报. 2019(02)
[6]LeETR4沉默对番茄果实成熟的影响[J]. 张策,谢远红,朱本忠. 食品科技. 2018(11)
[7]棉花GhTGA1与GhTGA9.2基因克隆及表达特征分析[J]. 赵曾强,李潇玲,张析,张薇,练文明. 华北农学报. 2018(05)
[8]棉花ERF-B3亚组转录因子基因GhERF5-1的克隆及表达[J]. 郭文婷,张鹏飞,李潇玲,张析,张薇. 江苏农业科学. 2018(19)
[9]VIGS诱导SL-ZH22基因沉默下番茄耐盐性研究[J]. 李景富,张晓春,姜景彬,杨欢欢,赵婷婷,许向阳. 东北农业大学学报. 2018(10)
[10]水稻OsLecRK基因的亚细胞定位分析[J]. 闸雯俊,杨芳,张艳茗,游艾青. 湖北农业科学. 2018(17)
博士论文
[1]利用VIGS技术研究棉花抗逆基因功能[D]. 李芳军.中国农业大学 2014
[2]陆地棉抗黄萎病相关基因筛选及功能验证[D]. 张文蔚.中国农业科学院 2013
硕士论文
[1]GhMAPK和GhMAPKK在棉花应答链格孢抗性中的作用[D]. 高环.中国农业科学院 2018
[2]VIGS技术解析陆地棉抗黄萎病相关基因及GhB2功能初步鉴定[D]. 张华崇.中国农业科学院 2016
[3]棉花抗黄萎病相关基因GhSKIP35基因的克隆与功能验证[D]. 刘凯.中国农业科学院 2015
[4]大丽轮枝菌病程相关基因的筛选及棉花GbEDS1基因的克隆和功能初探[D]. 齐希梁.中国农业科学院 2013
本文编号：3107008
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