橡胶树白粉菌启动子WY172的克
发布时间：2021-04-12 14:09
受体细胞中外源基因的表达是植物基因工程中的关键问题,启动子是基因表达的重要调控序列之一,是基因表达调控的关键点。本研究中,通过生物信息学分析得到了一个来自橡胶树白粉菌（Oidium heveae B.A.Steinm.）的疑似内源启动子,命名为WY172。通过瞬时表达、GUS染色实验、GUS活性分析等对该启动子功能进行验证,引入外源功能基因HpaXm,通过稳定表达、微过敏、烟草花叶病毒（TMV）接种、实时荧光定量PCR、GUS活性检测等实验对WY172驱动HpaXm基因的表达效果进行探究,并通过诱导元件分析、诱导实验和GUS染色等对WY172的启动子类型进行了分析;采取对WY172启动子上游2K序列进行渐变缺失突变、诱导元件分析和启动子活性分析等方法进行分析,探究WY172是否具有多元化诱导的可能性。主要结果如下:1.获得了重组表达载体pBI121-GFP（转空载体）、pBI121-ACT1（阳性对照）、pBI121-WY172,证明WY172具有启动子功能,可以驱动报告基因GUS的表达,并且在单子叶植物水稻和双子叶植物烟草中均能发挥启动子作用。2.构建了pBI121-WY172-Hp...
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同片段插入pBI121载体的结构示意
海南大学硕士学位论文27倍（图2，c）。结果证明WY172是一个可以驱动单子叶植物水稻和双子叶植物烟草中外源基因表达的启动子。同时为了确定不同启动子片段的GUS酶活性，绘制了BSA标准曲线和4-MU标准曲线，R2值分别为0.9997（图3，a）和0.9994（图3，b），满足测定要求。SPSS软件对酶活性的统计分析表明，WY172驱动GUS表达的活性在烟草和水稻中分别是35S和ACT1的2倍多（图3，c；图3，d），这证明无论是在单子叶植物水稻还是双子叶植物烟草中，WY172均具有启动子活性。图2烟草和水稻的不同菌株瞬时表达的GUS表达差异Fig.2DifferencesinGUSExpressionofTransientExpressionofDifferentAgrobacteriumStrainsinTobaccoandRice显示了农杆菌侵染五天后，阴性对照品系（GFP和WT）和三个转基因品系（CaMV35S，ACT1，WY172）GUS表达的结果，其中ACT1是单子叶植物水稻中的阳性对照，而CaMV35S是双子叶植物烟草中的阳性对照。a水稻和烟草瞬时表达后的GUS染色结果，b是烟草中GUS基因相对表达量，c是水稻中GUS基因的相对表达量。条形图上方的不同小写字母表示不同数据的多次比较之间存在显着差异（P<0.05）。实验设置三次重复，获得一致结果。FivedaysafterAgrobacteriuminfection,thenegativecontrollines(GFPandWT)andthreetransgeniclines(CaMV35S,ACT1,WY172)GUSexpressionresults,whereACT1isapositivecontrolinmonocotyledonousrice,andCaMV35Sisapositivecontrolofdicotyledonoustobacco.AndaistheGUSstainingaftertransientexpressionofriceandtobacco,bistherelativeexpressionlevelofGUSgeneintobacco,andcistherelativeexpressionlevelofGUSgeneinrice.Thedifferentlowercaselettersabovethebarsindicatesignificantd
橡胶树白粉菌启动子WY172的克垄功能鉴定及其对HpaXm基因的调控分析28图3烟草叶盘和水稻愈伤组织中瞬时表达的不同启动子的GUS活性差异Fig.3GUSDifferencesinGUSactivityofdifferentpromoterstransientlyexpressedintobaccoleavesandricecallus农杆菌侵染五天后，测定不同菌株侵染后烟草和水稻的GUS活性，其中ACT1是单子叶植物水稻中的阳性对照，而CaMV35S是双子叶植物烟草中的阳性对照。aBSA蛋白标准曲线，b4-MU标准曲线，c烟草中的GUS活性，d水稻中的GUS活性。条形图上方的不同小写字母表示不同数据的多次比较之间存在显着差异（P<0.05）。实验设置三次重复，获得一致结果。FivedaysaftertheinfectionwithAgrobacterium,theGUSactivityoftobaccoandriceafterdifferentstrainsofinfectionwasdeterminedACT1wasapositivecontrolinmonocotyledonousrice,andCaMV35Swasapositivecontrolindicotyledonoustobacco.AndaisBSAproteinstandardcurve,bis4-MUstandardcurve,cisGUSactivityintobacco,disGUSactivityinrice.Theexperimentwasrepeatedthreetimestoobtainconsistentresults.Thedifferentlowercaselettersabovethebarsindicatesignificantdifferencesinmultiplecomparisonsofdata(P<0.05).Theexperimentwasrepeatedthreetimes,eachyieldingsimilarresults.3.2WY172驱动HpaXm基因在烟草中的稳定表达3.2.1植物表达载体pBI121-172-HpaXm的构建及转基因烟草的获得将pBI121-WY172及阳性对照pBI121载体中的报告基因GUS替换为HpaXm基因，获得了新的植物表达载体pBI121-WY172-HpaXm。并通过ATMT方法将pBI121-WY172-HpaXm及pBI121-HpaXm整合到了烟草基因组中，获得T1代转基因烟草植株（图4，A）。筛选了可能包含WY172和HpaXm的26
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物组织特异性启动子研究进展[J]. 焦勇,柳小庆,江海洋,陈茹梅. 中国农业科技导报. 2019(01)
[2]启动子研究进展[J]. 李法君. 生物学教学. 2017(07)
[3]不同长度ThVHAc1基因启动子片段分离及活性分析[J]. 杨桂燕,郭宇聪,张凤娇,赵震,高彩球. 林业科学. 2016(01)
[4]转hpaXm烟草及其对TMV抗病性分析[J]. 李乐,缪卫国,郑服丛,刘文波,谢琳琳. 热带生物学报. 2015(04)
[5]启动子分析方法的研究进展[J]. 王秋岩,何淑雅,马云,李俐娟,李斌元. 现代生物医学进展. 2015(14)
[6]真核启动子研究进展[J]. 汤方,涂慧珍. 林业科技开发. 2015(02)
[7]白木香查尔酮合成酶基因（AsCHS1）启动子克隆及激素应答元件功能的初步鉴定[J]. 曹天骏,戴好富,李辉亮,郭冬,梅文莉,彭世清. 热带作物学报. 2014(10)
[8]组织特异性启动子在作物基因工程中的研究进展[J]. 贺红霞,陈亮,林春晶,柳青. 中国农学通报. 2014(09)
[9]植物诱导型启动子研究进展[J]. 孙芳芳,宋洪元. 南方园艺. 2014(02)
[10]鱼类基因启动子的研究进展[J]. 杜小溪,高祥刚,陈潘海,汪洋,赫崇波. 生物技术通报. 2013(08)
博士论文
[1]水稻组织特异表达启动子的分离克隆、功能分析及应用[D]. 叶荣建.华中农业大学 2012
[2]病原诱导启动子和组织特异性启动子的分离克隆和功能鉴定[D]. 蔡萌.华中农业大学 2007
硕士论文
[1]大豆GmWRI1a基因启动子克隆及其功能分析[D]. 邵宇鹏.东北农业大学 2019
[2]垂花百合花青素基因 ANS 启动子的克隆及功能分析[D]. 阴婷.沈阳农业大学 2016
[3]丁香假单胞大豆致病变种harpin蛋白HrpZPsgS1抗病和促生功能域及转录组研究[D]. 张阳.南京农业大学 2015
[4]两个玉米纹枯病病原诱导启动子的克隆与功能鉴定[D]. 位书佟.山东农业大学 2014
[5]拟南芥干旱诱导型启动子的克隆及功能分析[D]. 吴宪.吉林大学 2013
[6]玉米干旱诱导型基因启动子的克隆及功能分析[D]. 胡瑞学.吉林大学 2011
[7]瑞氏木霉纤维二糖水解酶（CBHⅠ）丝状真菌表达体系的构建[D]. 孟祥锋.山东大学 2010
本文编号：3133435
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同片段插入pBI121载体的结构示意
海南大学硕士学位论文27倍（图2，c）。结果证明WY172是一个可以驱动单子叶植物水稻和双子叶植物烟草中外源基因表达的启动子。同时为了确定不同启动子片段的GUS酶活性，绘制了BSA标准曲线和4-MU标准曲线，R2值分别为0.9997（图3，a）和0.9994（图3，b），满足测定要求。SPSS软件对酶活性的统计分析表明，WY172驱动GUS表达的活性在烟草和水稻中分别是35S和ACT1的2倍多（图3，c；图3，d），这证明无论是在单子叶植物水稻还是双子叶植物烟草中，WY172均具有启动子活性。图2烟草和水稻的不同菌株瞬时表达的GUS表达差异Fig.2DifferencesinGUSExpressionofTransientExpressionofDifferentAgrobacteriumStrainsinTobaccoandRice显示了农杆菌侵染五天后，阴性对照品系（GFP和WT）和三个转基因品系（CaMV35S，ACT1，WY172）GUS表达的结果，其中ACT1是单子叶植物水稻中的阳性对照，而CaMV35S是双子叶植物烟草中的阳性对照。a水稻和烟草瞬时表达后的GUS染色结果，b是烟草中GUS基因相对表达量，c是水稻中GUS基因的相对表达量。条形图上方的不同小写字母表示不同数据的多次比较之间存在显着差异（P<0.05）。实验设置三次重复，获得一致结果。FivedaysafterAgrobacteriuminfection,thenegativecontrollines(GFPandWT)andthreetransgeniclines(CaMV35S,ACT1,WY172)GUSexpressionresults,whereACT1isapositivecontrolinmonocotyledonousrice,andCaMV35Sisapositivecontrolofdicotyledonoustobacco.AndaistheGUSstainingaftertransientexpressionofriceandtobacco,bistherelativeexpressionlevelofGUSgeneintobacco,andcistherelativeexpressionlevelofGUSgeneinrice.Thedifferentlowercaselettersabovethebarsindicatesignificantd
橡胶树白粉菌启动子WY172的克垄功能鉴定及其对HpaXm基因的调控分析28图3烟草叶盘和水稻愈伤组织中瞬时表达的不同启动子的GUS活性差异Fig.3GUSDifferencesinGUSactivityofdifferentpromoterstransientlyexpressedintobaccoleavesandricecallus农杆菌侵染五天后，测定不同菌株侵染后烟草和水稻的GUS活性，其中ACT1是单子叶植物水稻中的阳性对照，而CaMV35S是双子叶植物烟草中的阳性对照。aBSA蛋白标准曲线，b4-MU标准曲线，c烟草中的GUS活性，d水稻中的GUS活性。条形图上方的不同小写字母表示不同数据的多次比较之间存在显着差异（P<0.05）。实验设置三次重复，获得一致结果。FivedaysaftertheinfectionwithAgrobacterium,theGUSactivityoftobaccoandriceafterdifferentstrainsofinfectionwasdeterminedACT1wasapositivecontrolinmonocotyledonousrice,andCaMV35Swasapositivecontrolindicotyledonoustobacco.AndaisBSAproteinstandardcurve,bis4-MUstandardcurve,cisGUSactivityintobacco,disGUSactivityinrice.Theexperimentwasrepeatedthreetimestoobtainconsistentresults.Thedifferentlowercaselettersabovethebarsindicatesignificantdifferencesinmultiplecomparisonsofdata(P<0.05).Theexperimentwasrepeatedthreetimes,eachyieldingsimilarresults.3.2WY172驱动HpaXm基因在烟草中的稳定表达3.2.1植物表达载体pBI121-172-HpaXm的构建及转基因烟草的获得将pBI121-WY172及阳性对照pBI121载体中的报告基因GUS替换为HpaXm基因，获得了新的植物表达载体pBI121-WY172-HpaXm。并通过ATMT方法将pBI121-WY172-HpaXm及pBI121-HpaXm整合到了烟草基因组中，获得T1代转基因烟草植株（图4，A）。筛选了可能包含WY172和HpaXm的26
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物组织特异性启动子研究进展[J]. 焦勇,柳小庆,江海洋,陈茹梅. 中国农业科技导报. 2019(01)
[2]启动子研究进展[J]. 李法君. 生物学教学. 2017(07)
[3]不同长度ThVHAc1基因启动子片段分离及活性分析[J]. 杨桂燕,郭宇聪,张凤娇,赵震,高彩球. 林业科学. 2016(01)
[4]转hpaXm烟草及其对TMV抗病性分析[J]. 李乐,缪卫国,郑服丛,刘文波,谢琳琳. 热带生物学报. 2015(04)
[5]启动子分析方法的研究进展[J]. 王秋岩,何淑雅,马云,李俐娟,李斌元. 现代生物医学进展. 2015(14)
[6]真核启动子研究进展[J]. 汤方,涂慧珍. 林业科技开发. 2015(02)
[7]白木香查尔酮合成酶基因（AsCHS1）启动子克隆及激素应答元件功能的初步鉴定[J]. 曹天骏,戴好富,李辉亮,郭冬,梅文莉,彭世清. 热带作物学报. 2014(10)
[8]组织特异性启动子在作物基因工程中的研究进展[J]. 贺红霞,陈亮,林春晶,柳青. 中国农学通报. 2014(09)
[9]植物诱导型启动子研究进展[J]. 孙芳芳,宋洪元. 南方园艺. 2014(02)
[10]鱼类基因启动子的研究进展[J]. 杜小溪,高祥刚,陈潘海,汪洋,赫崇波. 生物技术通报. 2013(08)
博士论文
[1]水稻组织特异表达启动子的分离克隆、功能分析及应用[D]. 叶荣建.华中农业大学 2012
[2]病原诱导启动子和组织特异性启动子的分离克隆和功能鉴定[D]. 蔡萌.华中农业大学 2007
硕士论文
[1]大豆GmWRI1a基因启动子克隆及其功能分析[D]. 邵宇鹏.东北农业大学 2019
[2]垂花百合花青素基因 ANS 启动子的克隆及功能分析[D]. 阴婷.沈阳农业大学 2016
[3]丁香假单胞大豆致病变种harpin蛋白HrpZPsgS1抗病和促生功能域及转录组研究[D]. 张阳.南京农业大学 2015
[4]两个玉米纹枯病病原诱导启动子的克隆与功能鉴定[D]. 位书佟.山东农业大学 2014
[5]拟南芥干旱诱导型启动子的克隆及功能分析[D]. 吴宪.吉林大学 2013
[6]玉米干旱诱导型基因启动子的克隆及功能分析[D]. 胡瑞学.吉林大学 2011
[7]瑞氏木霉纤维二糖水解酶（CBHⅠ）丝状真菌表达体系的构建[D]. 孟祥锋.山东大学 2010
本文编号：3133435
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