玉米小斑病菌O小种分化鉴定与非编码RNA效应物研究
发布时间：2021-04-19 18:34
玉米小斑病（southern corn leaf blight,SCLB）是我国玉米主要叶部病害,其病原菌异旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus）分为O、C、S、T四个生理小种。O小种是我国优势小种,但相关致病机理报道较少。本文对黄淮海、南方甜糯玉米产区小斑病菌小种分布及O小种致病力分化进行研究,并从全转录组角度分析O小种侵染机制,得到以下主要结果:1.玉米小斑病菌生理小种致病性分化鉴定2012-2016年对全国26个玉米产区进行调查采样,鉴定O小种为我国玉米小斑病菌优势小种,其他三个小种分离率较低。O小种菌在我国分为强、中、弱三个类群,中等致病力为优势类群。五年间黄淮海产区各致病力类群所占比例相对南方玉米产区更为稳定。2.玉米小斑病菌O小种转录组分析与非编码RNA效应物预测对侵染位点的病原菌O小种进行转录组分析,强致病力菌株DY和弱致病力菌株WF间共有3142个差异mRNA。GO注释发现差异基因功能主要与信号转导、氧化还原酶类、跨膜转运、降解酶等相关。在O小种共发现2799个新circRNA和169个新lncRNA,0-0.5hpi侵染阶段有1292个差异...
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：177 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
主要缩略词与中英文对照
第一章 文献综述
1.玉米小斑病发生与病原菌生理分化
1.1 玉米小斑病的发生
1.2 玉米小斑病菌致病机理
2.玉米小斑病菌O小种致病性分化研究进展
2.1 O小种致病力分化机理研究现状
2.2 寄主-病原互作对病原菌致病性分化的影响
3.非编码RNA的生物学功能和在病原微生物-寄主互作中的研究进展
3.1 microRNA
3.2 long noncoding RNA（lncRNA）
3.3 环状RNA（circle RNA,circRNA）
4. 非编码RNA在植物-病原菌互作中的作用
4.1 microRNA在植物病原互作中的角色
4.2 其他类型非编码RNA类效应物的预测
5.科学问题的提出与研究内容
第二章 中国玉米小斑病菌小种鉴定、区域分布规律以及致病力相关分子标记初探
1. 材料与方法
1.1 田间调查与标样采集
1.2 菌株分离、纯化与鉴定
1.2.1 菌株分离与纯化
1.2.2 菌株分类学鉴定
1.2.3 菌株的保存
1.2.4 试剂耗材等
1.3 玉米小斑病菌小种鉴定
1.3.1 T小种离体鉴定
1.3.2 O、C、T小种鉴别寄主鉴定
1.3.3 菌株、试剂耗材等
1.4 玉米小斑病菌O小种致病力鉴定
1.4.1 病原菌接种方法
1.4.2 病斑图像扫描与定量分析
1.4.3 玉米自交系、试剂耗材等
1.5 玉米小斑病菌全基因组重测序
1.5.1 测序文库构建
1.5.2 文库质检
1.5.3 Cluster生成
1.5.4 上机测序
1.5.5 数据分析
1.5.6 全基因组重测序所需试剂等
1.6 分子标记在强弱致病力分化菌株中初步验证
2. 结果与分析
2.1 玉米小斑病菌采集和鉴定
2.2 T小种离体鉴定
2.3 玉米小斑病菌生理小种的鉴别寄主鉴定
2.4 O小种致病力分化鉴定
2.5 O小种致病力分化的分子标记与关联性分析
2.5.1 强弱致病力菌株基因组差异分析
2.5.2 小种致病力分析分子标记的筛选
3.小结与讨论
第三章 玉米小斑病菌O小种不同致病类型侵染寄主过程
1. 材料与方法
1.1 O小种强、弱致病菌株来源
1.2 不同致病类型菌株GFP标记
1.2.1 GFP标记质粒
1.2.2 1300th-GFP质粒转化大肠杆菌和农杆菌
1.2.3 ATMT转化 1300th-GFP进入玉米小斑病菌
1.2.4 培养基、缓冲液和酶等
1.3 强、弱致病菌株单细胞纯化
1.4 强、弱致病菌株生长和侵染观察
1.5 试剂、缓冲液和仪器耗材
1.6 激光捕获显微切割
2. 结果与分析
2.1 玉米小斑病菌荧光标记与性状观察
2.2 强、弱病力菌株侵染过程的比较观察
2.2.1 在叶表萌发速度的差异
2.2.2 菌丝侵染结构观察
2.3 侵染 60-72hpi的真菌材料激光显微捕获切割
3. 小结与讨论
第四章 玉米小斑病菌O小种转录组分析
1. 材料与方法
1.1 total RNA纯化与质控
1.2 total RNA反转录放大成cDNA
1.2.1 第一链cDNA合成
1.2.2 第二链cDNA合成
1.2.3 cDNA纯化
1.2.4 cDNA SPIA放大
1.2.5 SPIA放大后修饰I
1.2.6 cDNA纯化
1.2.7 cDNA质控
1.2.8 相关试剂、缓冲液、耗材
1.3 参考基因组
1.4 测序数据识别和质量评估
1.5 全转录本测序饱和度分析
1.6 转录本重建/组装分析
1.7 非编码RNA（lncRNA、circRNA）预测
1.7.1 lncRNA预测步骤
1.7.2 circRNA预测步骤
1.8 全转录本（m RNA、lncRNA、circRNA）表达量分析
1.9 致病类型间的全转录本差异分析
1.10 致病类型间共表达基因时间浓度曲线分析
1.11 DY-GFP WF-GFP侵染过程中全转录本加权共表达分析
2. 结果与分析
2.1 total RNA的抽提和质控
2.2 RNA反转录放大到cDNA
2.3 全转录本测序质量分析
2.3.1 全转录本测序数据量
2.3.2 全转录本RNA测序质量
2.3.3 全转录本测序饱和度
2.3.4 转录本重建/组装
2.3.5 非编码RNA（lncRNA、circRNA）预测
2.3.6 转录组（m RNA、lncRNA、circRNA）主成分表达量分析
2.4 O小种侵染过程中的转录本分析
2.4.1 转录本整体差异分析
2.4.2 mRNA差异分析与功能注释
2.4.3 lncRNA差异分析
2.4.4 强致病类型侵染不同阶段circRNA表达模式
2.5 不同致病类型表达规律一致基因分析
2.5.1 mRNA时间浓度曲线分析与功能注释
2.5.2 STC相同模块基因与致病力相关数据库的比对
2.5.3 lncRNA时间浓度曲线分析
2.5.4 circRNA时间浓度曲线分析
2.6 全转录本加权共表达分析
2.7 转录circRNA的基因偏好性分析
3. 小结与讨论
3.1 小斑病菌O小种侵染过程中的差异转录组分析
3.2 编码类基因、非编码类基因与病原菌致病力三者之间的联系
第五章 玉米小斑病菌O小种circRNA效应物功能研究
1. 材料与方法
1.1 cexRNET（competition exogenous RNA network,外源竞争性RNA）预测
1.2 环状RNA预测
1.2.1 环状RNA剪接位置序列验证
1.2.2 环状RNA对RNaseR耐受性
1.3 环状RNA对应基因的线性RNA转录产物鉴定
1.4 环状RNA原位杂交
1.5 Che-cirC2410基因敲除
1.6 zma-miR399e5P的亚细胞定位
1.7 荧光定量检测microRNA和mRNA表达量
1.8 Che-cirC2410与zma-miR399e5P的互作验证
1.9 zma-miR399e5P和靶基因瞬时沉默
1.10 zma-miR399e5P的模拟物（mimics）和拮抗剂（antagomir）
1.11 Western Blot
2. 结果与讨论
2.1 cexRNET网络预测结果
2.2 环状RNA的分析验证
2.2.1 环状RNA验证
2.2.2 Che-cirC2410序列分析
2.2.3 Che-cirC2410的环状RNA特征分析
2.3 Che-cirC2410和zma-miR399e5P亚细胞定位
2.4 zma-miR399e5P和Che-cirC2410功能分析
2.5 zma-miR399e5P与Che-cirC2410的互作验证
2.5.1 荧光素酶报告系统验证zma-miR399e5P与Che-cirC2410互作
2.5.2 Che-cirC2410和zma-miR399e5P在互作过程中的表达量对应关系
2.6 zma-miR399e5P的功能验证
2.6.1 zma-miR399e5P对靶标基因表达的影响规律
2.6.2 zma-miR399e5P与靶标基因BAK1互作对寄主抗病性的影响
2.7 其他抗性相关基因的表达规律
2.8 小结与讨论
第六章 论文主要结论、创新点、与展望
1. 论文主要结论
1.1 玉米小斑病菌生理小种分化鉴定与分子化标记筛选
1.2 O小种侵染寄主过程中的全转录组规律
1.3 寄主-病原菌互作中的非编码RNA分子特征与功能
1.4 寄主抗性相关基因BAK1的功能
2. 主要创新点
2.1 玉米小斑病菌O小种侵染过程中的编码/非编码RNA转录组分析
2.2 发现O小种circRNA效应物与寄主microRNA受体
3.本文研究不足
4. 展望
参考文献
附录
1.附表
2.附图
3.论文克隆到的基因序列
4.博士期间发表文章
5.参与完成课题:
6.主要参加学术会议
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]福建省玉米小斑病菌的致病型及其群体结构分析[J]. 甘林,代玉立,阮宏椿,石妞妞,杜宜新,陈福如,杨秀娟. 中国农学通报. 2018(07)
[2]新乡地区玉米小斑病菌小种群体结构及致病性分析[J]. 陆宁海,吴利民,郎剑锋,霍云凤,石明旺. 河南科技学院学报(自然科学版). 2016(01)
[3]河南省玉米小斑病菌生理小种鉴定及致病力分化[J]. 陆宁海,吴利民,郎剑锋,霍云凤,石明旺. 湖北农业科学. 2015(07)
[4]玉米小斑病流行特点及防治技术综述[J]. 王良发,张守林,徐国举,张金奎,王海军,靳海蕾,郭冰. 安徽农学通报. 2014(19)
[5]黄淮海地区玉米小斑病菌生理小种鉴定与评价[J]. 赵聚莹,蒋晓丽,贾海民,李术臣,石洁,张海剑. 河北农业科学. 2012(09)
[6]不同玉米自交系对小斑病和灰斑病的抗性分析[J]. 邢光耀. 玉米科学. 2008(05)
[7]玉米病害发生现状与推广品种抗性对未来病害发展的影响[J]. 王晓鸣,晋齐鸣,石洁,王作英,李晓. 植物病理学报. 2006(01)
[8]河北省玉米小斑病菌生理小种鉴定及群体动态变化[J]. 孔令晓,赵聚莹,栗秋生,王连生,罗畔池. 华北农学报. 2005(03)
[9]不同玉米品种对玉米小斑病抗性的调查[J]. 杜学林,邢光耀,郑丽英. 作物杂志. 2004(06)
[10]玉米新种质资源对多种病害的抗病性鉴定[J]. 王连生,孔令晓,赵聚,罗畔池. 河北农业大学学报. 2001(04)
本文编号：3148088
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：177 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
主要缩略词与中英文对照
第一章 文献综述
1.玉米小斑病发生与病原菌生理分化
1.1 玉米小斑病的发生
1.2 玉米小斑病菌致病机理
2.玉米小斑病菌O小种致病性分化研究进展
2.1 O小种致病力分化机理研究现状
2.2 寄主-病原互作对病原菌致病性分化的影响
3.非编码RNA的生物学功能和在病原微生物-寄主互作中的研究进展
3.1 microRNA
3.2 long noncoding RNA（lncRNA）
3.3 环状RNA（circle RNA,circRNA）
4. 非编码RNA在植物-病原菌互作中的作用
4.1 microRNA在植物病原互作中的角色
4.2 其他类型非编码RNA类效应物的预测
5.科学问题的提出与研究内容
第二章 中国玉米小斑病菌小种鉴定、区域分布规律以及致病力相关分子标记初探
1. 材料与方法
1.1 田间调查与标样采集
1.2 菌株分离、纯化与鉴定
1.2.1 菌株分离与纯化
1.2.2 菌株分类学鉴定
1.2.3 菌株的保存
1.2.4 试剂耗材等
1.3 玉米小斑病菌小种鉴定
1.3.1 T小种离体鉴定
1.3.2 O、C、T小种鉴别寄主鉴定
1.3.3 菌株、试剂耗材等
1.4 玉米小斑病菌O小种致病力鉴定
1.4.1 病原菌接种方法
1.4.2 病斑图像扫描与定量分析
1.4.3 玉米自交系、试剂耗材等
1.5 玉米小斑病菌全基因组重测序
1.5.1 测序文库构建
1.5.2 文库质检
1.5.3 Cluster生成
1.5.4 上机测序
1.5.5 数据分析
1.5.6 全基因组重测序所需试剂等
1.6 分子标记在强弱致病力分化菌株中初步验证
2. 结果与分析
2.1 玉米小斑病菌采集和鉴定
2.2 T小种离体鉴定
2.3 玉米小斑病菌生理小种的鉴别寄主鉴定
2.4 O小种致病力分化鉴定
2.5 O小种致病力分化的分子标记与关联性分析
2.5.1 强弱致病力菌株基因组差异分析
2.5.2 小种致病力分析分子标记的筛选
3.小结与讨论
第三章 玉米小斑病菌O小种不同致病类型侵染寄主过程
1. 材料与方法
1.1 O小种强、弱致病菌株来源
1.2 不同致病类型菌株GFP标记
1.2.1 GFP标记质粒
1.2.2 1300th-GFP质粒转化大肠杆菌和农杆菌
1.2.3 ATMT转化 1300th-GFP进入玉米小斑病菌
1.2.4 培养基、缓冲液和酶等
1.3 强、弱致病菌株单细胞纯化
1.4 强、弱致病菌株生长和侵染观察
1.5 试剂、缓冲液和仪器耗材
1.6 激光捕获显微切割
2. 结果与分析
2.1 玉米小斑病菌荧光标记与性状观察
2.2 强、弱病力菌株侵染过程的比较观察
2.2.1 在叶表萌发速度的差异
2.2.2 菌丝侵染结构观察
2.3 侵染 60-72hpi的真菌材料激光显微捕获切割
3. 小结与讨论
第四章 玉米小斑病菌O小种转录组分析
1. 材料与方法
1.1 total RNA纯化与质控
1.2 total RNA反转录放大成cDNA
1.2.1 第一链cDNA合成
1.2.2 第二链cDNA合成
1.2.3 cDNA纯化
1.2.4 cDNA SPIA放大
1.2.5 SPIA放大后修饰I
1.2.6 cDNA纯化
1.2.7 cDNA质控
1.2.8 相关试剂、缓冲液、耗材
1.3 参考基因组
1.4 测序数据识别和质量评估
1.5 全转录本测序饱和度分析
1.6 转录本重建/组装分析
1.7 非编码RNA（lncRNA、circRNA）预测
1.7.1 lncRNA预测步骤
1.7.2 circRNA预测步骤
1.8 全转录本（m RNA、lncRNA、circRNA）表达量分析
1.9 致病类型间的全转录本差异分析
1.10 致病类型间共表达基因时间浓度曲线分析
1.11 DY-GFP WF-GFP侵染过程中全转录本加权共表达分析
2. 结果与分析
2.1 total RNA的抽提和质控
2.2 RNA反转录放大到cDNA
2.3 全转录本测序质量分析
2.3.1 全转录本测序数据量
2.3.2 全转录本RNA测序质量
2.3.3 全转录本测序饱和度
2.3.4 转录本重建/组装
2.3.5 非编码RNA（lncRNA、circRNA）预测
2.3.6 转录组（m RNA、lncRNA、circRNA）主成分表达量分析
2.4 O小种侵染过程中的转录本分析
2.4.1 转录本整体差异分析
2.4.2 mRNA差异分析与功能注释
2.4.3 lncRNA差异分析
2.4.4 强致病类型侵染不同阶段circRNA表达模式
2.5 不同致病类型表达规律一致基因分析
2.5.1 mRNA时间浓度曲线分析与功能注释
2.5.2 STC相同模块基因与致病力相关数据库的比对
2.5.3 lncRNA时间浓度曲线分析
2.5.4 circRNA时间浓度曲线分析
2.6 全转录本加权共表达分析
2.7 转录circRNA的基因偏好性分析
3. 小结与讨论
3.1 小斑病菌O小种侵染过程中的差异转录组分析
3.2 编码类基因、非编码类基因与病原菌致病力三者之间的联系
第五章 玉米小斑病菌O小种circRNA效应物功能研究
1. 材料与方法
1.1 cexRNET（competition exogenous RNA network,外源竞争性RNA）预测
1.2 环状RNA预测
1.2.1 环状RNA剪接位置序列验证
1.2.2 环状RNA对RNaseR耐受性
1.3 环状RNA对应基因的线性RNA转录产物鉴定
1.4 环状RNA原位杂交
1.5 Che-cirC2410基因敲除
1.6 zma-miR399e5P的亚细胞定位
1.7 荧光定量检测microRNA和mRNA表达量
1.8 Che-cirC2410与zma-miR399e5P的互作验证
1.9 zma-miR399e5P和靶基因瞬时沉默
1.10 zma-miR399e5P的模拟物（mimics）和拮抗剂（antagomir）
1.11 Western Blot
2. 结果与讨论
2.1 cexRNET网络预测结果
2.2 环状RNA的分析验证
2.2.1 环状RNA验证
2.2.2 Che-cirC2410序列分析
2.2.3 Che-cirC2410的环状RNA特征分析
2.3 Che-cirC2410和zma-miR399e5P亚细胞定位
2.4 zma-miR399e5P和Che-cirC2410功能分析
2.5 zma-miR399e5P与Che-cirC2410的互作验证
2.5.1 荧光素酶报告系统验证zma-miR399e5P与Che-cirC2410互作
2.5.2 Che-cirC2410和zma-miR399e5P在互作过程中的表达量对应关系
2.6 zma-miR399e5P的功能验证
2.6.1 zma-miR399e5P对靶标基因表达的影响规律
2.6.2 zma-miR399e5P与靶标基因BAK1互作对寄主抗病性的影响
2.7 其他抗性相关基因的表达规律
2.8 小结与讨论
第六章 论文主要结论、创新点、与展望
1. 论文主要结论
1.1 玉米小斑病菌生理小种分化鉴定与分子化标记筛选
1.2 O小种侵染寄主过程中的全转录组规律
1.3 寄主-病原菌互作中的非编码RNA分子特征与功能
1.4 寄主抗性相关基因BAK1的功能
2. 主要创新点
2.1 玉米小斑病菌O小种侵染过程中的编码/非编码RNA转录组分析
2.2 发现O小种circRNA效应物与寄主microRNA受体
3.本文研究不足
4. 展望
参考文献
附录
1.附表
2.附图
3.论文克隆到的基因序列
4.博士期间发表文章
5.参与完成课题:
6.主要参加学术会议
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]福建省玉米小斑病菌的致病型及其群体结构分析[J]. 甘林,代玉立,阮宏椿,石妞妞,杜宜新,陈福如,杨秀娟. 中国农学通报. 2018(07)
[2]新乡地区玉米小斑病菌小种群体结构及致病性分析[J]. 陆宁海,吴利民,郎剑锋,霍云凤,石明旺. 河南科技学院学报(自然科学版). 2016(01)
[3]河南省玉米小斑病菌生理小种鉴定及致病力分化[J]. 陆宁海,吴利民,郎剑锋,霍云凤,石明旺. 湖北农业科学. 2015(07)
[4]玉米小斑病流行特点及防治技术综述[J]. 王良发,张守林,徐国举,张金奎,王海军,靳海蕾,郭冰. 安徽农学通报. 2014(19)
[5]黄淮海地区玉米小斑病菌生理小种鉴定与评价[J]. 赵聚莹,蒋晓丽,贾海民,李术臣,石洁,张海剑. 河北农业科学. 2012(09)
[6]不同玉米自交系对小斑病和灰斑病的抗性分析[J]. 邢光耀. 玉米科学. 2008(05)
[7]玉米病害发生现状与推广品种抗性对未来病害发展的影响[J]. 王晓鸣,晋齐鸣,石洁,王作英,李晓. 植物病理学报. 2006(01)
[8]河北省玉米小斑病菌生理小种鉴定及群体动态变化[J]. 孔令晓,赵聚莹,栗秋生,王连生,罗畔池. 华北农学报. 2005(03)
[9]不同玉米品种对玉米小斑病抗性的调查[J]. 杜学林,邢光耀,郑丽英. 作物杂志. 2004(06)
[10]玉米新种质资源对多种病害的抗病性鉴定[J]. 王连生,孔令晓,赵聚,罗畔池. 河北农业大学学报. 2001(04)
本文编号：3148088
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