晚疫病菌非寄主无毒基因的鉴定和马铃薯抗病基因的分子改造
发布时间：2021-05-18 12:09
由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产中的毁灭性病害。培育抗晚疫病品种成为马铃薯育种的主要目标之一。致病疫霉是目前已知基因组最大的卵菌,编码超过500个RXLR类效应分子,它们通过抑制寄主的多重防卫反应,或劫持植物感病因子,为入侵和增殖创造合适的环境。本研究针对RXLR效应分子在非寄主植物龙葵上的识别和马铃薯抗病基因的体外修饰,开展了两部分工作,取得以下研究结果:1.以晚疫病菌A1融合群黑龙江分离菌株（HLJ）为模板,合作构建包含251个RXLR效应分子的基因库。通过瞬时表达系统,筛选到三个特异性引起龙葵（SN022）过敏性坏死反应（HR）的候选无毒基因并开展了功能研究:（1）PITG16245.2。PITG16245.2在致病疫霉侵染马铃薯活体营养阶段被显著上调表达,在马铃薯和本氏烟中超量表达该基因能够下调寄主的防卫相关基因的表达,影响寄主的正常生长并促进感病;PITG16245.2在11个致病疫霉菌株中均有同源序列,其中6个同源序列丧失在SN022上激发HR能力,结合基因定点突变分析发现,其第53、66、70和78...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：119 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
ABSTRACT
1 前言
1.1 马铃薯晚疫病
1.1.1 马铃薯
1.1.2 马铃薯晚疫病
1.2 致病疫霉
1.2.1 致病疫霉的效应分子
1.2.2 致病疫霉的RXLR效应分子
1.2.3 RXLR效应分子的功能
1.2.3.1 抑制植物PTI
1.2.3.2 激起植物ETI
1.2.3.3 逃脱植物抗病基因监测
1.2.3.4 抑制植物ETI
1.2.4 RXLR效应分子进入寄主的机理
1.2.5 RXLR效应分子抑制植物免疫反应的机理
1.2.5.1 稳定植物免疫的负调控因子促进致病疫霉的侵染
1.2.5.2 干扰植物免疫的正向调控因子促进致病疫霉的侵染
1.2.5.3 改变自身或互作蛋白的定位促进致病疫霉的侵染
1.2.5.4 影响寄主免疫的其他路径
1.3 植物抗病性
1.3.1 寄主抗性
1.3.2 抗病基因概况
1.3.3 非寄主抗性
1.3.3.1 预存性/组成性抗性
1.3.3.2 诱导抗性
1.3.4 非寄主抗性基因的克隆应用
1.3.5 致病疫霉的非寄主抗性研究进展
1.3.6 马铃薯晚疫病的非寄主—龙葵
1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株和载体
2.1.2 供试植物
2.1.3 马铃薯晚疫病菌
2.1.4 常用缓冲液及培养基的配制
2.1.5 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
2.2 方法
2.2.1 引物设计
2.2.2 载体构建
2.2.2.1 DNA提取
2.2.2.2 RNA提取
2.2.2.3 cDNA的获取
2.2.2.4 目的片段的获取
2.2.2.5 酶切载体的构建
2.2.2.6 gateway方法载体的构建
2.2.2.7 In-fusion方法载体的构建
2.2.3 RXLR类效应分子瞬时表达基因库的构建
2.2.4 基因定点突变分析
2.2.5 基因的瞬时表达
2.2.6 晚疫病的叶片离体接种法
2.2.6.1 致病疫霉的培养及游动孢子的获得
2.2.6.2 叶片离体接种
2.2.7 荧光定量检测
2.2.7.1 基因表达量的检测
2.2.7.2 菌丝生长量的检测
2.2.8 本氏烟的遗传转化
2.2.9 马铃薯的遗传转化
2.2.10 无选择标记转基因马铃薯的诱导获得
2.2.11 酵母cDNA文库的构建及筛选
2.2.11.1 酵母cDNA文库的构建
2.2.11.2 酵母cDNA文库的筛选
2.2.12 蛋白互作鉴定
2.2.12.1 酵母双杂交检测蛋白互作
2.2.12.2 免疫共沉淀检测蛋白互作
2.2.12.2.1 免疫印迹杂交
2.2.12.2.2 免疫共沉淀
2.2.12.3 荧光双分子互补检测蛋白互作
2.2.13 病毒介导的基因沉默
2.2.14 蛋白的原核表达
3 实验结果
3.1 候选效应分子的筛选
3.1.1 RXLR效应分子瞬时表达基因库的构建
3.1.2 龙葵特异性识别的候选无毒基因的筛选
3.2 候选无毒基因的功能分析
3.2.1 候选无毒基因PITG_16245.2的功能分析
3.2.1.1 PITG_16245.2HLJ在致病疫霉侵染龙葵过程中被上调表达
3.2.1.2 PITG_16245.2存在序列多态性,存在可以逃脱龙葵检测的同源序列
3.2.1.3 PITG_16245.2第53,66,70和78位氨基酸是龙葵识别的关键位点
3.2.1.4 PITG_16245.2HLJ在致病疫侵染阶段被诱导上调表达
3.2.1.5 PITG_16245.2HLJ促进致病疫霉在本氏烟定殖
3.2.1.6 PITG_16245.2HLJ促进致病疫霉在马铃薯上定殖
3.2.1.7 逃脱龙葵检测的PITG_16245.23928A并不影响其促进侵染的功能
3.2.1.8 PITG_16245.2HLJ能够与PR4b互作
3.2.1.9 PR4b在致病疫霉侵染阶段被诱导上调表达并能抑制致病疫霉的定殖
3.2.1.10 PITG_16245.2HLJ通过改变St PR4b的亚细胞定位促进致病疫霉的侵染
3.2.1.11 SnPR4b是龙葵识别PITG_16245.2HLJ的关键基因
3.2.2 候选无毒基因PITG_20301.2的功能验证
3.2.2.1 PITG_20301.2的序列分析
3.2.2.2 PITG_20301.2第43位氨基酸是龙葵识别的关键位点
3.2.2.3 PITG_20301.2HLJ能够促进致病疫霉在本氏烟的定殖
3.2.2.4 PITG_20301.2HLJ能够促进致病疫霉在马铃薯的定殖
3.2.2.5 PITG_20301.2HLJ能够抑制INF1,NIP,Avh238和Avh241引起的细胞死亡
3.2.3 候选无毒基因PITG_04194.1的功能验证
3.2.3.1 PITG_04194.1的序列分析
3.2.3.2 PITG_04194.1HLJ能够促进致病疫霉在寄主上的定殖
3.2.3.3 PITG_04194.1HLJ能够抑制抗病相关基因的表达
3.2.3.4 PITG_04194.1HLJ能够抑制BAX,INF1,NIP,Avh238和Avh241在本氏烟上引起的HR
3.3 非寄主识别候选效应分子的机理
3.3.1 不同龙葵品种识别候选效应分子不同
3.3.2 龙葵中SnPR4b能够直接识别三个候选无毒基因
3.3.3 沉默SnPR4b能够影响龙葵对三个候选效应分子的识别
3.3.4 SnPR4b能与SnLRR1互作
3.3.5 SnLRR1仅能够影响龙葵对PITG_16245.2HLJ的识别
3.3.6 非寄主识别候选无毒基因的机理
3.4 启动子置换创制新的马铃薯抗晚疫病基因Rpi-OM1.2
3.4.1 新的马铃薯抗晚疫病基因Rpi-OM1.2的创制策略
3.4.2 Rpi-OM1.2能够提高马铃薯对致病疫霉的抗性
3.4.3 无选择标记的Rpi-OM1.2株系的获得
3.4.4 无选择标记的Rpi-OM1.2株系的抗性检测
3.4.5 Rpi-OM1.2识别的候选无毒基因筛选
4 讨论
4.1 PITG_16245.2具有多重功能
4.2 候选无毒基因PITG_20301.2HLJ和PITG_04194.1HLJ的功能研究
4.3 龙葵识别候选无毒基因的机理
4.4 启动子置换能够创制新的无不良影响高抗晚疫病抗病基因
5 结论
6 参考文献
7 附录
7.1 常用缓冲液及培养基的配制
7.1.1 细菌培养基
7.1.2 质粒抽提液
7.1.3 植物遗传转化培养基以及常用贮液配方
7.2 常用化学试剂、分子生物学试剂
7.2.1 常用化学试剂
7.2.2 分子生物学试剂
7.3 本实验所用的引物序列表
8 致谢
9 攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国马铃薯晚疫病菌交配型研究进展[J]. 王腾,孙继英,汝甲荣,王立春. 中国马铃薯. 2018(01)
[2]RXLR类效应分子PITG21645.2的基因序列分析及功能验证[J]. 李金徽,王娇,高存钢,王博,张瑾瑾,尹军良,丁新华,储昭辉. 植物病理学报. 2018(01)
[3]龙葵抗肿瘤作用机制研究进展[J]. 安磊,唐劲天,刘新民,高南南. 中国中药杂志. 2006(15)
[4]微波辅助提取龙葵中总生物碱的研究[J]. 刘覃,陈晓青,蒋新宇,吴升德. 天然产物研究与开发. 2005(01)
[5]野生龙葵果中营养成分的研究[J]. 米拉,杨秋林,那顺孟和,李金梅,阿荣. 内蒙古农业大学学报(自然科学版). 2002(01)
[6]CIP的全球晚疫病防治倡仪与我国的参与[J]. 宋伯符,谢开云. 中国马铃薯. 1997(01)
[7]中国龙葵复合种细胞学分析和地理分布的研究[J]. 杨永年,张海洋,吴国宜. 植物研究. 1994(02)
博士论文
[1]大豆疫霉中CRN效应分子在本氏烟中的功能分析[D]. Nasir Ahmed Rajput.南京农业大学 2014
[2]非寄主抗性基因介导水稻抗细菌性条斑病的分子机理及水稻抗白叶枯病材料的筛选和QTL定位[D]. 许美容.中国农业科学院 2011
硕士论文
[1]品种多样性对马铃薯晚疫病菌群体遗传结构的影响[D]. 覃雁瑜.福建农林大学 2014
[2]马铃薯晚疫病抗病基因的分子改造和水稻白叶枯病菌IAA合成途径相关基因鉴定[D]. 李海萍.山东农业大学 2011
本文编号：3193763
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：119 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
ABSTRACT
1 前言
1.1 马铃薯晚疫病
1.1.1 马铃薯
1.1.2 马铃薯晚疫病
1.2 致病疫霉
1.2.1 致病疫霉的效应分子
1.2.2 致病疫霉的RXLR效应分子
1.2.3 RXLR效应分子的功能
1.2.3.1 抑制植物PTI
1.2.3.2 激起植物ETI
1.2.3.3 逃脱植物抗病基因监测
1.2.3.4 抑制植物ETI
1.2.4 RXLR效应分子进入寄主的机理
1.2.5 RXLR效应分子抑制植物免疫反应的机理
1.2.5.1 稳定植物免疫的负调控因子促进致病疫霉的侵染
1.2.5.2 干扰植物免疫的正向调控因子促进致病疫霉的侵染
1.2.5.3 改变自身或互作蛋白的定位促进致病疫霉的侵染
1.2.5.4 影响寄主免疫的其他路径
1.3 植物抗病性
1.3.1 寄主抗性
1.3.2 抗病基因概况
1.3.3 非寄主抗性
1.3.3.1 预存性/组成性抗性
1.3.3.2 诱导抗性
1.3.4 非寄主抗性基因的克隆应用
1.3.5 致病疫霉的非寄主抗性研究进展
1.3.6 马铃薯晚疫病的非寄主—龙葵
1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株和载体
2.1.2 供试植物
2.1.3 马铃薯晚疫病菌
2.1.4 常用缓冲液及培养基的配制
2.1.5 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
2.2 方法
2.2.1 引物设计
2.2.2 载体构建
2.2.2.1 DNA提取
2.2.2.2 RNA提取
2.2.2.3 cDNA的获取
2.2.2.4 目的片段的获取
2.2.2.5 酶切载体的构建
2.2.2.6 gateway方法载体的构建
2.2.2.7 In-fusion方法载体的构建
2.2.3 RXLR类效应分子瞬时表达基因库的构建
2.2.4 基因定点突变分析
2.2.5 基因的瞬时表达
2.2.6 晚疫病的叶片离体接种法
2.2.6.1 致病疫霉的培养及游动孢子的获得
2.2.6.2 叶片离体接种
2.2.7 荧光定量检测
2.2.7.1 基因表达量的检测
2.2.7.2 菌丝生长量的检测
2.2.8 本氏烟的遗传转化
2.2.9 马铃薯的遗传转化
2.2.10 无选择标记转基因马铃薯的诱导获得
2.2.11 酵母cDNA文库的构建及筛选
2.2.11.1 酵母cDNA文库的构建
2.2.11.2 酵母cDNA文库的筛选
2.2.12 蛋白互作鉴定
2.2.12.1 酵母双杂交检测蛋白互作
2.2.12.2 免疫共沉淀检测蛋白互作
2.2.12.2.1 免疫印迹杂交
2.2.12.2.2 免疫共沉淀
2.2.12.3 荧光双分子互补检测蛋白互作
2.2.13 病毒介导的基因沉默
2.2.14 蛋白的原核表达
3 实验结果
3.1 候选效应分子的筛选
3.1.1 RXLR效应分子瞬时表达基因库的构建
3.1.2 龙葵特异性识别的候选无毒基因的筛选
3.2 候选无毒基因的功能分析
3.2.1 候选无毒基因PITG_16245.2的功能分析
3.2.1.1 PITG_16245.2HLJ在致病疫霉侵染龙葵过程中被上调表达
3.2.1.2 PITG_16245.2存在序列多态性,存在可以逃脱龙葵检测的同源序列
3.2.1.3 PITG_16245.2第53,66,70和78位氨基酸是龙葵识别的关键位点
3.2.1.4 PITG_16245.2HLJ在致病疫侵染阶段被诱导上调表达
3.2.1.5 PITG_16245.2HLJ促进致病疫霉在本氏烟定殖
3.2.1.6 PITG_16245.2HLJ促进致病疫霉在马铃薯上定殖
3.2.1.7 逃脱龙葵检测的PITG_16245.23928A并不影响其促进侵染的功能
3.2.1.8 PITG_16245.2HLJ能够与PR4b互作
3.2.1.9 PR4b在致病疫霉侵染阶段被诱导上调表达并能抑制致病疫霉的定殖
3.2.1.10 PITG_16245.2HLJ通过改变St PR4b的亚细胞定位促进致病疫霉的侵染
3.2.1.11 SnPR4b是龙葵识别PITG_16245.2HLJ的关键基因
3.2.2 候选无毒基因PITG_20301.2的功能验证
3.2.2.1 PITG_20301.2的序列分析
3.2.2.2 PITG_20301.2第43位氨基酸是龙葵识别的关键位点
3.2.2.3 PITG_20301.2HLJ能够促进致病疫霉在本氏烟的定殖
3.2.2.4 PITG_20301.2HLJ能够促进致病疫霉在马铃薯的定殖
3.2.2.5 PITG_20301.2HLJ能够抑制INF1,NIP,Avh238和Avh241引起的细胞死亡
3.2.3 候选无毒基因PITG_04194.1的功能验证
3.2.3.1 PITG_04194.1的序列分析
3.2.3.2 PITG_04194.1HLJ能够促进致病疫霉在寄主上的定殖
3.2.3.3 PITG_04194.1HLJ能够抑制抗病相关基因的表达
3.2.3.4 PITG_04194.1HLJ能够抑制BAX,INF1,NIP,Avh238和Avh241在本氏烟上引起的HR
3.3 非寄主识别候选效应分子的机理
3.3.1 不同龙葵品种识别候选效应分子不同
3.3.2 龙葵中SnPR4b能够直接识别三个候选无毒基因
3.3.3 沉默SnPR4b能够影响龙葵对三个候选效应分子的识别
3.3.4 SnPR4b能与SnLRR1互作
3.3.5 SnLRR1仅能够影响龙葵对PITG_16245.2HLJ的识别
3.3.6 非寄主识别候选无毒基因的机理
3.4 启动子置换创制新的马铃薯抗晚疫病基因Rpi-OM1.2
3.4.1 新的马铃薯抗晚疫病基因Rpi-OM1.2的创制策略
3.4.2 Rpi-OM1.2能够提高马铃薯对致病疫霉的抗性
3.4.3 无选择标记的Rpi-OM1.2株系的获得
3.4.4 无选择标记的Rpi-OM1.2株系的抗性检测
3.4.5 Rpi-OM1.2识别的候选无毒基因筛选
4 讨论
4.1 PITG_16245.2具有多重功能
4.2 候选无毒基因PITG_20301.2HLJ和PITG_04194.1HLJ的功能研究
4.3 龙葵识别候选无毒基因的机理
4.4 启动子置换能够创制新的无不良影响高抗晚疫病抗病基因
5 结论
6 参考文献
7 附录
7.1 常用缓冲液及培养基的配制
7.1.1 细菌培养基
7.1.2 质粒抽提液
7.1.3 植物遗传转化培养基以及常用贮液配方
7.2 常用化学试剂、分子生物学试剂
7.2.1 常用化学试剂
7.2.2 分子生物学试剂
7.3 本实验所用的引物序列表
8 致谢
9 攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国马铃薯晚疫病菌交配型研究进展[J]. 王腾,孙继英,汝甲荣,王立春. 中国马铃薯. 2018(01)
[2]RXLR类效应分子PITG21645.2的基因序列分析及功能验证[J]. 李金徽,王娇,高存钢,王博,张瑾瑾,尹军良,丁新华,储昭辉. 植物病理学报. 2018(01)
[3]龙葵抗肿瘤作用机制研究进展[J]. 安磊,唐劲天,刘新民,高南南. 中国中药杂志. 2006(15)
[4]微波辅助提取龙葵中总生物碱的研究[J]. 刘覃,陈晓青,蒋新宇,吴升德. 天然产物研究与开发. 2005(01)
[5]野生龙葵果中营养成分的研究[J]. 米拉,杨秋林,那顺孟和,李金梅,阿荣. 内蒙古农业大学学报(自然科学版). 2002(01)
[6]CIP的全球晚疫病防治倡仪与我国的参与[J]. 宋伯符,谢开云. 中国马铃薯. 1997(01)
[7]中国龙葵复合种细胞学分析和地理分布的研究[J]. 杨永年,张海洋,吴国宜. 植物研究. 1994(02)
博士论文
[1]大豆疫霉中CRN效应分子在本氏烟中的功能分析[D]. Nasir Ahmed Rajput.南京农业大学 2014
[2]非寄主抗性基因介导水稻抗细菌性条斑病的分子机理及水稻抗白叶枯病材料的筛选和QTL定位[D]. 许美容.中国农业科学院 2011
硕士论文
[1]品种多样性对马铃薯晚疫病菌群体遗传结构的影响[D]. 覃雁瑜.福建农林大学 2014
[2]马铃薯晚疫病抗病基因的分子改造和水稻白叶枯病菌IAA合成途径相关基因鉴定[D]. 李海萍.山东农业大学 2011
本文编号：3193763
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/dzwbhlw/3193763.html
最近更新
教材专著
