凤仙花坏死环斑病毒单克隆抗体的制备与番茄斑萎病毒云南样品的田间检测

发布时间：2021-05-20 20:21

　　凤仙花坏死环斑病毒（Impatiens necrotic spot virus,INSV）与番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus.TSWV）同属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）,番茄斑萎病毒属（Tospovirus）。两者均有广泛的寄主范围,西花蓟马（Frankliniella.occidentalis）是它们共同的传播介体。两种病毒在侵染植物后的症状上有很多的相同之处,主要表现为:植株矮化,茎或叶片上出现环状或紫褐色的斑,茎会有腐烂现象,可以出现碎色花等。但是凤仙花坏死环斑病毒主要侵染花卉等观赏植物,而番茄斑萎病毒侵染蔬菜等重要农作物,两种病毒在全世界的大规模传播给栽培种植者带来了巨大的经济损失。为了制备凤仙花坏死环斑病毒单克隆抗体,将抗原注射入免疫小鼠体内,可以使其体内的脾细胞具有产生抗体的能力,但这种产生抗体的细胞并不具备癌细胞所具有的无限增殖的能力。如果在融合剂的作用下将两种能力不同的细胞进行细胞融合形成杂交瘤细胞,就会使其拥有这两种细胞的能力。再通过筛选得到只分泌我们所需要的抗体的单一 B淋巴细胞,对其单独进行培养,这样就能获得单克隆抗体... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词
绪论
上篇 文献综述
    第一章 凤仙花坏死环斑病毒的主要概况
        1.1 凤仙花坏死环斑病毒的特征
        1.2 凤仙花坏死环斑病毒基因组结构和功能
        1.3 INSV的病毒检测
            1.3.1 传统生物学方法
            1.3.2 电镜检测法
            1.3.3 血清学检测方法
            1.3.4 分子生物学检测方法
        1.4 INSV的危害与防治
    第二章 番茄斑萎病毒的主要概况
        2.1 番茄斑萎病毒生物学特性
        2.2 病毒粒子特性
        2.3 TSWV的检测方法
            2.3.1 电镜检测方法
            2.3.2 血清学检测方法
            2.3.3 分子生物学检测方法
        2.4 TSWV的防治
    第三章 单克隆抗体的研究概况
        3.1 单克隆抗体技术的定义与背景
        3.2 单克隆抗体技术的原理
        3.3 单克隆抗体的制备过程
            3.3.1 动物免疫
            3.3.2 骨髓瘤细胞的饲养
            3.3.3 细胞融合
            3.3.4 选择性培养
            3.3.5 杂交瘤细胞的选择培养与筛选
            3.3.6 单克隆抗体的大量制备
            3.3.7 单克隆抗体的纯化
        3.4 单克隆抗体的优势与应用
            3.4.1 单克隆抗体的研究现状
                3.4.1.1 鼠源性单抗
                3.4.1.2 嵌合抗体
                3.4.1.3 人源化抗体
                3.4.1.4 人源性抗体
            3.4.2 单克隆抗体的应用与前景展望
                3.4.2.1 单克隆抗体的优势
                3.4.2.2 单克隆抗体的应用
                3.4.2.3 单克隆抗体所面临的问题
                3.4.2.4 单克隆抗体的前景展望
下篇 研究内容
    第四章 凤仙花坏死环斑病毒单克隆抗体制备
        4.1 实验材料
            4.1.1 细胞与免疫动物
            4.1.2 试剂
            4.1.3 主要仪器
        4.2 方法
            4.2.1 构建抗原载体
                4.2.1.1 提取病毒RNA
                4.2.1.2 载体构成
                4.2.1.3 转化
                4.2.1.4 筛选阳性克隆
                4.2.1.5 提取质粒并进行测序
            4.2.2 免疫抗原的获取
                4.2.2.1 原核表达
                4.2.2.2 SDS-PAGE电泳
                4.2.3.3 蛋白质透析
            4.2.3 小鼠免疫
            4.2.4 小鼠尾血效价的测定
            4.2.5 细胞融合
                4.2.5.1 SP2/0的复苏与饲养
                4.2.5.2 饲养细胞的制备
                4.2.5.3 免疫脾细胞的制备
                4.2.5.4 细胞融合
            4.2.6 融合后细胞的选择性培养
            4.2.7 单克隆细胞株的筛选
            4.2.8 阳性杂交瘤细胞株的克隆化
            4.2.9 阳性杂交瘤细胞株的建立
            4.2.10 杂交瘤细胞株的冻存与复苏
            4.2.11 小鼠腹水抗体的制备与纯化
            4.2.12 纯化后抗体效价的检测
        4.3 结果
            4.3.1 INSV免疫抗原重组蛋白原核表达和纯化
            4.3.2 小鼠尾血效价的测定
            4.3.3 单克隆抗体细胞株的建立
            4.3.4 对纯化后的单克隆抗体进行效价测定
                4.3.4.1 1E1细胞株系效价的测定
                4.3.4.2 2D9细胞株系效价的测定
        4.4 讨论
        4.5 结论
    第五章 番茄斑萎病毒云南样品的田间诊断
        5.1 材料
            5.1.1 主要试剂
            5.1.2 主要仪器
        5.2 方法
            5.2.1 TSWV的摩擦接种
            5.2.2 DOT-ELISA法检测 TSWV
            5.2.3 RT-PCR技术检测TSWV
        5.3 结果
            5.3.1 TSWV的田间采样
            5.3.2 毒源的保存与摩擦接种到本氏烟
            5.3.3 血清学检测方法
            5.3.4 分子生物学检测方法
            5.3.5 INSV单克隆抗体检测TSWV
        5.4 讨论
        5.5 结论
全文总结
创新点
参考文献
附录
致谢
硕士期间参与发表的研究论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]杂交瘤技术制备单克隆抗体研究进展[J]. 张琳琳.  生物学教学. 2016(08)
[2]生产用重组哺乳动物细胞株的克隆筛选方法[J]. 徐睿瑶,蔡洁行,张玉彬.  中国细胞生物学学报. 2015(05)
[3]单克隆抗体的研究进展[J]. 唐亚华,黄红林.  生物技术世界. 2015(03)
[4]单克隆抗体制备的关键因素[J]. 张蕾,马凡舒,闫喜军,徐淑娟.  特产研究. 2015(01)
[5]番茄斑萎病毒研究进展[J]. 尼秀媚,陈长法,封立平,吴兴海,徐琼.  安徽农业科学. 2014(19)
[6]杂交瘤技术与单克隆抗体[J]. 任娟.  新疆畜牧业. 2014(04)
[7]腹水型单克隆抗体纯化方法的研究[J]. 肖增鸿,黄昭亮,林月霞,董斌,田素娟.  中国医药生物技术. 2013(06)
[8]番茄斑萎病毒检测技术发展趋势概述[J]. 习凤妮,谭新球,朱春晖,孙书娥,张德咏,刘勇.  湖南农业科学. 2013(05)
[9]单克隆抗体研究进展[J]. 刘萍,陈苗苗,刘学荣,牟克斌,黄银君.  中国畜牧兽医. 2012(01)
[10]单克隆抗体制备技术及应用的研究进展[J]. 郭粉粉,梁文波,张学梅.  医学综述. 2011(08)



本文编号：3198378