核盘菌对菌核净的抗性机理研究

发布时间：2021-05-20 21:05

　　油菜菌核病是由核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]引起的一种真菌性病害。该病害可发生在油菜的整个生育期,严重影响油菜产量与品质。二甲酰亚胺类杀菌剂菌核净在我国用于防治油菜菌核病已有十几年,目前部分地区已监测到菌核净的抗性菌株。本研究以室内诱导的菌核净抗性菌株和田间抗性菌株为试验材料,测定了室内诱导和田间抗性菌株菌核净抗性水平的遗传稳定性,研究了室内诱导抗性菌株冷藏4年后的生物学特性;比较分析了田间菌核净抗性与敏感菌株生理生化差异;通过PCR技术扩增组氨酸激酶HK基因Sshk、反应调控蛋白基因Sssk1、组氨酸磷酸转移酶基因Ss Ypd和促分裂原活化蛋白激酶基因MAPK（Sssk2、Ss Pbs和Ss Hog）,并对其序列进行比对,应用RNAi技术研究核盘菌对菌核净的抗性机理。主要研究结果如下:1.在PDA上连续培养20代后,田间菌核净抗性菌株（HLJ3、HLJ4和HLJ6）的抗性可以稳定遗传,经4℃冷藏4年后,菌核净抗性依然稳定;而室内诱导抗性菌株（SCG7和LA50）的抗性在无药PDA上逐渐衰退,冷藏4年后,对菌核净的抗性分别下降了99... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：117 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第1章 前言
    1.1 核盘菌
    1.2 二甲酰亚胺类杀菌剂(DCFs)菌核净
    1.3 核盘菌对苯并咪唑类及DCF类杀菌剂抗药性研究进展
        1.3.1 核盘菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性
        1.3.2 核盘菌对DCFs的抗性
        1.3.3 核盘菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性机制
        1.3.4 核盘菌对DCFs的抗性机制
    1.4 双组份信号传导系统与MAPK级联通路
        1.4.1 双组份信号传导系统
        1.4.2 丝状植物病原真菌的双组份信号传导系统
        1.4.3 MAPK级联通路
    1.5 根癌农杆菌介导真菌遗传转化
    1.6 RNA干扰(RNAi)技术
        1.6.1 RNAi作用机理
        1.6.2 RNAi介导真菌基因功能的研究
    1.7 立题依据与研究意义
    1.8 技术路线
第2章 菌核净抗性遗传稳定性及室内诱导抗性突变体冷藏后的生物学特性
    2.1 材料和方法
        2.1.1 供试菌株
        2.1.2 药剂
        2.1.3 仪器设备
        2.1.4 供试菌株活化
        2.1.5 药液配制
        2.1.6 菌核净抗性遗传稳定性测定
        2.1.7 菌核净室内诱导抗性突变体冷藏后对其它药剂的敏感性测定
        2.1.8 菌核净室内诱导抗性突变体冷藏后产核能力、生长速率及致病性测定
        2.1.9 菌核净室内诱导抗性突变体冷藏后渗透压敏感性测定
        2.1.10 数据分析
    2.2 结果与分析
        2.2.1 菌核净抗性的遗传稳定性
        2.2.2 菌核净室内诱导抗性突变体冷藏后对其它药剂的敏感性
        2.2.3 菌核净室内诱导抗性突变体冷藏后产核、生长速率及致病性
        2.2.4 菌核净室内诱导抗性突变体冷藏后渗透压敏感性
    2.3 讨论
第3章 核盘菌对菌核净抗性生化机制研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 供试菌株
        3.1.2 药剂及试剂
        3.1.3 仪器设备
        3.1.4 菌核净抗性与敏感菌株的草酸含量测定
        3.1.5 菌核净抗性与敏感菌株菌丝甘油含量测定
        3.1.6 菌核净抗性与敏感菌株菌丝细胞膜通透性测定
        3.1.7 菌核净抗性与敏感菌株POD和PPO活性测定
        3.1.8 数据分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 菌核净抗性与敏感菌株的草酸含量
        3.2.2 菌核净抗性与敏感菌株菌丝甘油含量
        3.2.3 菌核净抗性与敏感菌株菌丝细胞膜通透性
        3.2.4 菌核净抗性与敏感菌株的POD和PPO酶活性
    3.3 讨论
第4章 核盘菌双组份信号传导及MAPK级联相关基因克隆
    4.1 材料与方法
        4.1.1 供试菌株
        4.1.2 试剂
        4.1.3 仪器设备
        4.1.4 引物设计
        4.1.5 核盘菌基因组DNA、总RNA提取及第一链cDNA合成
        4.1.6 PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增
        4.1.7 割胶回收
        4.1.8 连接
        4.1.9 大肠杆菌热击转化
        4.1.10 数据分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 核盘菌双组份信号传导及MAPK级联相关基因序列分析
        4.2.2 Sshk基因相对表达量分析
    4.3 讨论
第5章 核盘菌Sshk转录水平对菌核净抗性水平的影响研究
    5.1 材料和方法
        5.1.1 供试菌株
        5.1.2 供试质粒与载体
        5.1.3 试剂
        5.1.4 仪器设备
        5.1.5 引物设计
        5.1.6 核盘菌基因组DNA、总RNA提取及第一链cDNA合成
        5.1.7 质粒提取、双酶切和割胶回收
        5.1.8 Sshk基因载体构建
        5.1.9 重组质粒热击转化及电击转化
        5.1.10 农杆菌重组质粒鉴定
        5.1.11 农杆菌介导转化核盘菌
        5.1.12 转化子验证
        5.1.13 转化子对菌核净敏感性测定
        5.1.14 转化子生长速率及产核能力测定
        5.1.15 转化子致病力测定
        5.1.16 转化子对渗透压敏感性及对H_2O_2的氧化应激测定
        5.1.17 转化子细胞壁及细胞膜完整性测定
        5.1.18 转化子对不同温度敏感性测定
    5.2 结果与分析
        5.2.1 Sshk基因载体构建
        5.2.2 农杆菌重组质粒鉴定
        5.2.3 转化子验证
        5.2.4 转化子对菌核净的敏感性
        5.2.5 转化子产核能力及生长速率
        5.2.6 转化子的致病力
        5.2.7 转化子对渗透压敏感性
        5.2.8 转化子对H_2O_2的氧化应激反应
        5.2.9 转化子的细胞壁完整性
        5.2.10 转化子的细胞膜完整性
        5.2.11 转化子对不同温度敏感性
    5.3 讨论
第6章 总结与展望
    6.1 总结
    6.2 创新点
    6.3 展望
参考文献
附录Ⅰ 常用培养基及试剂配制
    1.1 常用培养基配制
    1.2 常用抗生素配制
    1.3 常用试剂配制
    1.4 感受态细胞制备
        1.4.1 E.coliDH5α感受态细胞制备
        1.4.2 农杆菌EHA105感受态细胞制备
附录Ⅱ 攻读博士学位期间发表论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]不同栽培模式及施氮方式对油菜产量和氮肥利用率的影响[J]. 刘波,鲁剑巍,李小坤,丛日环,吴礼树,叶川,郑伟,徐维明,姚忠清,任涛.  中国农业科学. 2016(18)
[2]野生大豆接种大豆疫霉根腐病菌后多酚氧化酶（PPO）活性变化[J]. 徐鹏飞,常敬礼,赵福华,唐鑫华,郭长军,张淑珍.  大豆科学. 2012(01)
[3]病毒诱导的基因沉默技术及其在植物中的研究进展[J]. 张新华,李富军.  西北植物学报. 2012(02)
[4]草莓枯萎病菌抗戊唑醇突变体ZY-W的生理生化特性[J]. 姜莉莉,王红艳,夏晓明,林琎,王开运.  农药学学报. 2012(01)
[5]江苏省油菜菌核病菌对多菌灵和菌核净的抗药性监测[J]. 匡静,王建新,周明国.  中国农学通报. 2011(15)
[6]油菜菌核病菌抗腐霉利菌株的生理生化特性及抗药机制初步分析[J]. 陈夕军,曹敏娟,孔维文,王艳,童蕴慧,徐敬友.  中国油料作物学报. 2010(04)
[7]玉米灰斑病菌粗毒素对玉米胚根保护酶活性的影响[J]. 王桂清,张涛,孙华,徐秀德.  沈阳农业大学学报. 2010(02)
[8]应用RNA干扰技术创造低脂肪氧化酶活性大豆新种质[J]. 马建,张君,曲静,王云鹏,魏益凡,王丕武.  中国农业科学. 2009(11)
[9]用RNA干扰技术创造高直链淀粉马铃薯材料[J]. 郭志鸿,张金文,王蒂,陈正华.  中国农业科学. 2008(02)
[10]江苏省油菜菌核病菌对多菌灵的敏感性[J]. 李伟,李伟,周益军,陈怀谷.  中国油料作物学报. 2007(01)

博士论文
[1]核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-Sl2功能研究[D]. 余洋.华中农业大学 2012

硕士论文
[1]核盘菌对二甲酰亚胺类杀菌剂菌核净的抗性机理研究[D]. 肖翔.华中农业大学 2013
[2]核盘菌菌核形成相关基因的筛选及功能验证[D]. 张敏.华中农业大学 2011
[3]油菜菌核病菌对多菌灵的抗药性研究[D]. 徐文杰.华中农业大学 2011
[4]油菜菌核病菌对腐霉利的抗性及其机制[D]. 曹敏娟.扬州大学 2008
[5]农杆菌介导核盘菌菌丝转化体系的建立及SsDRV下调基因Ss-CYP1的功能初步研究[D]. 江明.华中农业大学 2007
[6]丝状真菌遗传转化系统的建立[D]. 周庆新.山东农业大学 2007
[7]灰葡萄孢对腐霉利的抗性及其机制研究[D]. 王艳.扬州大学 2007



本文编号：3198428