dlt操纵子在苏云金芽胞杆菌与昆虫相互作用中的功能研究

发布时间：2021-06-16 20:24

　　大多数革兰氏阳性病原细菌如炭疽芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等都存在dlt操纵子,其功能是使细胞壁的磷壁酸发生D-丙氨酰化修饰,从而使细胞壁表面带正电荷,导致对宿主阳离子抗菌肽（AMPs）的抵抗力增强,逃避宿主免疫反应,这是病原微生物在与宿主相互作用过程中进化出的一种有效保护机制。苏云金芽胞杆菌（简称Bt）是昆虫及线虫的一种革兰氏阳性病原细菌,分析其基因组发现也有dlt操纵子的存在。Bt作为一种杀虫微生物,以杀虫晶体蛋白为其主要杀虫活性成分,在其与昆虫宿主相互作用过程中,病原和宿主都会进化出各种保护机制,从而提高其在自然界中的生存能力,dlt操纵子极有可能是Bt逃避昆虫宿主免疫反应的一种有效方式。因此,本研究通过敲除Bt菌株中dlt操纵子,分析其对Bt自身生长繁殖等基础生物学方面的影响,并探讨其在与昆虫宿主相互作用过程中的生物学功能。本研究利用同源重组技术敲除Bt无晶体突变株BMB171中dltA基因,成功构建了dltA基因缺失突变株,同时构建了互补株和空载体菌株。表面电荷差异分析表明dl 操纵子功能缺失可引起菌体细胞表面净负电荷显著增加,验证了其在Bt中具... 

【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－１?Ｃｒｙ毒素的孔洞形成模型［４６］??Ｆｉｇ．?１－１?Ｐｏｒｅ?ｆｏｒｍａｔｉｏｎ?ｍｏｄｅｌ?ｏｆ?Ｃｒｙ?ｔｏｘｉｎｓ１４６＾??

导致害虫对其抗性形成。目前，己有大量研宂表明Ｃｒｙ毒素蛋白能与多种膜蛋白??结合，包括碱性磷酸酶［５Ｑ］、氨肽酶祕４５］、钙黏蛋白［５１－５３］和人８＜：转运蛋白［５４］等，??图１－３中展示了毒素ＣｒｙｌＡｂ在烟草天蛾（Ｍｓｅｘｒａ）上的三个受体结合位点［５５］。??ｇｉＦ?—：「巧……．．：：ｒ??ＡＬＰ?ＡＰＮ??Ｃａｄｆａｅｒｉｎ??图１－３?ＣｒｙｌＡｂ毒素单体／低聚物与烟草天蛾上三个受体的结合位点［５５１??Ｆｉｇ．?１－３?Ｂｉｎｄｉｎｇ?ｒｅｇｉｏｎｓ?ｏｆ?ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ／ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ?ｆｏｒｍｓ?ｍａｐｐｅｄ?ｉｎ?Ｃｒｙｌ?Ａｂ?ｔｏｘｉｎ?ｔｏ?Ｍａｎｄｕｃａ??ｓｅｘｔａ?ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，?ｃａｄｈｅｒｉｎ，?ＡＬＰ?ａｎｄ?ＡＰＮ＾５５＾??但是Ｃｙｔ杀虫蛋白到目前为止还没有发现与之特异性相结合的膜受体，关于??其作用机理己有相关文献报道表明，Ｃｙｔ分子是不能直接与膜结合的，只有当其??被激活后先和位于膜上的不饱和脂肪酸发生亲和，再通过多个Ｃｙｔ分子寡聚化进??一步产生Ｐ－桶状跨膜结构，最终在细胞膜上形成孔隙，水和离子由孔大量进入细??胞质导致细胞裂解以及组织损伤??２．２营养期杀虫蛋白??营养期杀虫蛋白（ＶＩＰｓ）是Ｂｔ菌体在营养期这一生长阶段内形成的一类对??昆虫有高效毒杀活性的新型蛋白，达到了纳克级水平，它与ＩＣＰ在进化上没有同??７??

取Ｂｔ基因组作为模板，用引物对（ｉ／ｄｕｐ－Ｆ、ｃｆｅ４－ｕｐ－Ｒ和ｄ／Ｍ－ｄｏｗｎ－Ｆ、??』Ｌ４－ｄｏｗｎ－Ｒ扩增基因的上下游同源臂，得到５７７ｂｐ的上游臂和５７１ｂｐ的下??游同源臂（图３－１），胶回收片段后经双酶切、分步连接到ｐＲｅｃ－ｍｏｂ－Ｔｓ载体上，??构建流程如图３－２所示，热转至Ｚｃｏ／ｉ?ＤＨ５ｏｔ中，重组子￡．ｃｏ／ｚ＿?ＤＨ５ａ??（ｐＲｅｃ－ｍｏｂ－Ｔｓ－ｕｐ－ｄｏｗｎ）分别经?＿ＳａｗＨ?Ｉ、ｆｅｅ?Ｉ?和Ｉ、＆／１?双酶切鉴定（图?３－３?），??获得正确转化子。??ｂｐ??腿—??７５０?—??５００?—??２５０??图３－１?ｒｆ／ｄ基因上／下游同源臂ＰＣＲ产物分析??Ｆｉｇ．３－１?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｆｏｒ?ｄｌｔＡ?ｇｅｎｅ?ｕｐｓｔｒｅａｍ?／ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ??ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ａｒｍ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ??１?ｊ／Ｍ基因上游同源臂??２：?Ｊ／Ｍ基因下游同源臂??３５??

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本文编号：3233731