农杆菌介导生防酵母（34-9）转化体系的优化及转化子生防效力探究
发布时间：2021-06-22 21:40
野生型酵母菌株34-9,属于柠檬型克勒克酵母（Kloeckera apiculata）,具有抑制柑橘采后青绿霉病的生物防治作用,由于该菌易受环境影响,并且防治的病原菌种类单一,所以存在防治效果不稳定,抑菌谱较窄等问题。酵母菌株34-9的防治效果,可以通过对其基因进行改良的方式来优化,以实现在分子水平上对酵母的转化。本课题实验运用的转化方法为农杆菌介导,通过优化酵母的转化体系条件,包括预培养阶段是否加入乙酰丁香酮,酵母的浓度,共培养阶段的时间和温度,以及承载膜的类型,得到了稳定遗传的转化子,建立了酵母菌株34-9的遗传突变体库。同时,对获得的转化子进行了生防效力的初步探究,研究了转化子对柑橘采后酸腐病和炭疽病的防治效果。研究的主要结果如下:1.优化了农杆菌介导的条件:供体农杆菌AGL-1的OD600为0.6,酵母34-9的菌液浓度为8×107CFU/mL时,预培养阶段加入乙酰丁香酮,共培养阶段用滤纸作为承载膜,温度调至28℃,培养48h,达到的转化效率最高。2.通过对500个转化子进行生防效力检测,找到一株可以延缓酸腐菌AY-1发病的酵母转化子...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pTFCM-G418载体结构图
图 3-1 野生酵母 34-9 对潮霉素 B 的敏感性分析Fig.3-1 Assessment of sensitivity of 34-9 to hygromycin B在用农杆菌介导的方法转化生防酵母 34-9 之前，需要确定转化所用的。通过涂皿法，来确定 34-9 对潮霉素 B 的敏感程度。对于生防酵母 3了 6 种不同的潮霉素 B 浓度（0，50，100，200，300，400ug/mL），以素 B 的培养基为对照。图 3-1 为观察 7d 后的结果，实验结果显示，在 为 50ug/mL－300ug/mL 的浓度下，酵母 34-9 在平板上都有不同程度的潮霉素浓度的增大，酵母 34-9 的生长越来越受抑制，在 300ug/mL 时仅母单菌落生长。通过 3 次重复实验，在含 400ug/mL 潮霉素 B 培养基观 一直没有生长，最终确定了酵母 34-9 对潮霉素 B 的临界敏感浓ug/mL。
图 3-2 野生酵母 34-9 对 G418 的敏感性分析Fig.3-2 Assessment of sensitivity of 34-9 to G418采用涂皿法确定酵母 34-9对G418的敏感程度。设置了5种含不同浓度G418的培养基，G418 的浓度分别是 0，10，20，30，40ug/mL，以不含 G418 的培养基为对照，观察酵母 34-9 在培养基上的生长情况。图 3-2 为观察 7d 后的结果，在实验的前 2 天，酵母 34-9 就已经在含 0，10，20ug/mLG418 的培养基上生长，在含 30，40ug/mLG418 的培养基上不生长，此后继续观察，在第 5 天时，发现在含 30ug/mLG418 的培养基上零星的长出了酵母单菌落，而在含 40ug/mLG418培养基上，酵母 34-9 一直没有生长，直到一周之后，酵母 34-9 仍未在含40ug/mLG418 的培养基上生长，重复 3 次，实验结果一致，确定酵母 34-9 对 G418的临界敏感浓度为 40ug/mL。综上，当潮霉素 B 浓度为 400ug/mL 时，酵母 34-9 不再生长；当 G418 浓度为 40ug/mL 时，酵母 34-9 的生长被完全抑制，由此可见，同潮霉素 B 相比，酵母 34-9 对 G418 更敏感。所以最终选择 G418 为酵母转化实验的筛选标记。在转
【参考文献】：
期刊论文
[1]苯并噻二唑处理对柑橘果实采后病害控制效果及机制分析[J]. 刘晓佳,薛耀碧,周雅涵,姚世响,邓丽莉,曾凯芳. 食品科学. 2018(09)
[2]防治水果病害的生防酵母及生防制剂研究进展[J]. 李侨飞,张红印,杨其亚,林珍,程洋洋,孙艺文. 食品科学. 2018(01)
[3]世界柑橘产业现状及发展趋势[J]. 齐乐,祁春节. 农业展望. 2016(12)
[4]隐球酵母vps41Δ菌株转化条件优化及突变体库构建[J]. 宋瑛瑾,刘晓光. 生物技术通报. 2013 (12)
[5]拮抗微生物防治柑橘采后病害研究进展[J]. 郭娟华,涂起红,陈楚英,陈金印. 食品科学. 2013(23)
[6]农杆菌介导的基因敲除技术在丝状真菌基因功能研究中的应用[J]. 李彩红,李志芳,冯自力,赵丽红,师勇强,王玲飞,刘义杰,朱荷琴. 棉花学报. 2013(03)
[7]根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展[J]. 周芳芳,李志芳,冯自力,师勇强,赵丽红,李彩红,朱荷琴. 棉花学报. 2012(05)
[8]柠檬保鲜技术研究现状及前景展望[J]. 龚琪,朱春华,多建祖,高俊燕,岳建强. 安徽农业科学. 2012(20)
[9]马克斯克鲁维酵母对柑橘采后绿霉病的抑制效果[J]. 耿鹏,陈少华,胡美英,瞿菲,张彦博,安国栋. 华中农业大学学报. 2011(06)
[10]根癌农杆菌介导里氏木霉转化体系的建立和条件优化[J]. 刘刚,杨长得,康康,邢苗,田生礼. 生物技术. 2011(04)
博士论文
[1]根癌农杆菌介导申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变的研究[D]. 张艳华.吉林大学 2011
[2]拮抗酵母及结合热空气处理对樱桃番茄采后病害的防治及其机理研究[D]. 赵妍.南京农业大学 2010
[3]果实采后病害生物防治及其机理研究[D]. 范青.中国科学院植物研究所 2001
硕士论文
[1]柑橘采后生防菌34-9遗传转化体系的建立与优化[D]. 裴惠民.华中农业大学 2014
[2]农杆菌介导的指状青霉转化体系的建立[D]. 尤亮.华中农业大学 2014
[3]红色红曲霉T-DNA插入突变库的构建及GABA代谢相关基因的克隆[D]. 蔡琪敏.浙江师范大学 2012
[4]拮抗菌在草莓采后病害防治中的应用研究[D]. 曾璐.湖南农业大学 2008
[5]根癌农杆菌介导产甘油假丝酵母转化研究[D]. 张君胜.江南大学 2006
[6]酵母菌对柑橘采后病害的生物防治及防治机理的研究[D]. 彭景贤.福建农林大学 2006
本文编号：3243578
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pTFCM-G418载体结构图
图 3-1 野生酵母 34-9 对潮霉素 B 的敏感性分析Fig.3-1 Assessment of sensitivity of 34-9 to hygromycin B在用农杆菌介导的方法转化生防酵母 34-9 之前，需要确定转化所用的。通过涂皿法，来确定 34-9 对潮霉素 B 的敏感程度。对于生防酵母 3了 6 种不同的潮霉素 B 浓度（0，50，100，200，300，400ug/mL），以素 B 的培养基为对照。图 3-1 为观察 7d 后的结果，实验结果显示，在 为 50ug/mL－300ug/mL 的浓度下，酵母 34-9 在平板上都有不同程度的潮霉素浓度的增大，酵母 34-9 的生长越来越受抑制，在 300ug/mL 时仅母单菌落生长。通过 3 次重复实验，在含 400ug/mL 潮霉素 B 培养基观 一直没有生长，最终确定了酵母 34-9 对潮霉素 B 的临界敏感浓ug/mL。
图 3-2 野生酵母 34-9 对 G418 的敏感性分析Fig.3-2 Assessment of sensitivity of 34-9 to G418采用涂皿法确定酵母 34-9对G418的敏感程度。设置了5种含不同浓度G418的培养基，G418 的浓度分别是 0，10，20，30，40ug/mL，以不含 G418 的培养基为对照，观察酵母 34-9 在培养基上的生长情况。图 3-2 为观察 7d 后的结果，在实验的前 2 天，酵母 34-9 就已经在含 0，10，20ug/mLG418 的培养基上生长，在含 30，40ug/mLG418 的培养基上不生长，此后继续观察，在第 5 天时，发现在含 30ug/mLG418 的培养基上零星的长出了酵母单菌落，而在含 40ug/mLG418培养基上，酵母 34-9 一直没有生长，直到一周之后，酵母 34-9 仍未在含40ug/mLG418 的培养基上生长，重复 3 次，实验结果一致，确定酵母 34-9 对 G418的临界敏感浓度为 40ug/mL。综上，当潮霉素 B 浓度为 400ug/mL 时，酵母 34-9 不再生长；当 G418 浓度为 40ug/mL 时，酵母 34-9 的生长被完全抑制，由此可见，同潮霉素 B 相比，酵母 34-9 对 G418 更敏感。所以最终选择 G418 为酵母转化实验的筛选标记。在转
【参考文献】：
期刊论文
[1]苯并噻二唑处理对柑橘果实采后病害控制效果及机制分析[J]. 刘晓佳,薛耀碧,周雅涵,姚世响,邓丽莉,曾凯芳. 食品科学. 2018(09)
[2]防治水果病害的生防酵母及生防制剂研究进展[J]. 李侨飞,张红印,杨其亚,林珍,程洋洋,孙艺文. 食品科学. 2018(01)
[3]世界柑橘产业现状及发展趋势[J]. 齐乐,祁春节. 农业展望. 2016(12)
[4]隐球酵母vps41Δ菌株转化条件优化及突变体库构建[J]. 宋瑛瑾,刘晓光. 生物技术通报. 2013 (12)
[5]拮抗微生物防治柑橘采后病害研究进展[J]. 郭娟华,涂起红,陈楚英,陈金印. 食品科学. 2013(23)
[6]农杆菌介导的基因敲除技术在丝状真菌基因功能研究中的应用[J]. 李彩红,李志芳,冯自力,赵丽红,师勇强,王玲飞,刘义杰,朱荷琴. 棉花学报. 2013(03)
[7]根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展[J]. 周芳芳,李志芳,冯自力,师勇强,赵丽红,李彩红,朱荷琴. 棉花学报. 2012(05)
[8]柠檬保鲜技术研究现状及前景展望[J]. 龚琪,朱春华,多建祖,高俊燕,岳建强. 安徽农业科学. 2012(20)
[9]马克斯克鲁维酵母对柑橘采后绿霉病的抑制效果[J]. 耿鹏,陈少华,胡美英,瞿菲,张彦博,安国栋. 华中农业大学学报. 2011(06)
[10]根癌农杆菌介导里氏木霉转化体系的建立和条件优化[J]. 刘刚,杨长得,康康,邢苗,田生礼. 生物技术. 2011(04)
博士论文
[1]根癌农杆菌介导申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变的研究[D]. 张艳华.吉林大学 2011
[2]拮抗酵母及结合热空气处理对樱桃番茄采后病害的防治及其机理研究[D]. 赵妍.南京农业大学 2010
[3]果实采后病害生物防治及其机理研究[D]. 范青.中国科学院植物研究所 2001
硕士论文
[1]柑橘采后生防菌34-9遗传转化体系的建立与优化[D]. 裴惠民.华中农业大学 2014
[2]农杆菌介导的指状青霉转化体系的建立[D]. 尤亮.华中农业大学 2014
[3]红色红曲霉T-DNA插入突变库的构建及GABA代谢相关基因的克隆[D]. 蔡琪敏.浙江师范大学 2012
[4]拮抗菌在草莓采后病害防治中的应用研究[D]. 曾璐.湖南农业大学 2008
[5]根癌农杆菌介导产甘油假丝酵母转化研究[D]. 张君胜.江南大学 2006
[6]酵母菌对柑橘采后病害的生物防治及防治机理的研究[D]. 彭景贤.福建农林大学 2006
本文编号：3243578
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