CaWRKY71及其与CaWRKY40互作在辣椒应答青枯菌侵染中的作用
发布时间：2021-06-29 19:35
辣椒（Capsicum annuum L.）作为我国重要的蔬菜,是一种典型的土传病害多的茄科作物,常常发生病害,特别是在高温高湿条件下,病害频发且严重,影响辣椒产量和品质。研究辣椒抗病分子机制,有利于开展辣椒抗病遗传改良和培育抗病新品种。作为在高等植物中成员种类最多的转录因子家族成员之一,WRKY转录因子广泛地参与到植物各种生理生化过程的转录和调节当中,特别在植物对各种外源病原菌入侵及其它生境逆境防御反应的响应调节中发挥了重要的作用,剖析WRKY转录因子中各个成员在植物的抗病或耐逆中所存在的作用,是研究植物抗病或耐逆相关分子调控机制的重要内容以及可行方案。虽然前人研究发现CaWRKY6,CaWKRY27,CaWRKY40和CaWRKY58等辣椒WRKY家族成员在辣椒应答其重要土传病原菌青枯菌接种（RSI）或高温高湿（HTHH）逆境胁迫中起作用,但其分子仍不是很清楚。本研究通过酵母双杂交,分离获得CaWRKY40的互作蛋白CaWRKY71,并对Ca WRKY71的表达以及CaWRKY71与CaWRKY40互作在辣椒应答青枯病中的作用进行了研究,主要结果如下:（1）序列分析表明,Ca WR...
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图３－１?（ａ）辣椒ＣａＷＲＫＹ７１与其他物种中同源性相对较高的蛋白的氨基酸序列比对
Ｃ．ａＷＲＫＹ７１及其－Ｌｊ?ＣａＷＲＫＹ４０互作在辣椒应答青枯保ｉ侵染中的作用??元件。其中含有多个ＨＳＥ应答相关元件，暗示了其与高温胁迫的关系，并含有??三个保守的Ｗ－ｂｏｘ，这一结果暗示了该基因的表达极有可能与多种植物激素有??关，并且在逆境处理以及其他的ＷＲＫＹ转录因子的作用下受到调控（图３－２ａ）。??通过提取８叶期辣椒幼苗在青枯菌接种１２?ｈ以及２４?ｌｉ叶片的ｍＲＮＡ，并通过反??转录ＰＣＲ制作成ｃＤＮＡ文库作为模板，通过实时荧光定量ＰＣＲ分析ＣＶ／．／０７／??对青枯菌侵染的应答水平，我们发现该基因对青枯菌侵染的应答明显，该基因??的表达量在丨２?ｈ以及２４?ｈ都发生很明显的提高（图３－２ｂ）。我们对８叶期辣椒幼??苗的叶片喷施外源植物激素，并于２４?ｈ对辣椒叶片进行采样，提取ＲＮＡ，并逆??转录成ｃＤＮＡ后用实时荧光定量ＰＣＲ测定在不同植物激素处理下的??表达水平，发现在外源激素ＳＡ和ＥＴＨ的作用下被激活，而对其他??激素无明显应答（图３－２ｃ）。以上结果表明Ｑ／ＷＷＦ７７能在青枯菌侵染下被激活，??表达量明显提高，并且应答的是由乙烯利以及水杨酸介导的信号通路，这意味??着ｃｗｒａ／ｒｙｖ／很可能在辣椒应答青枯菌胁迫的抗逆反应相关信号通路中起到一??定作用。??ＣａＷＲＫＹ７１?ｐｒｏｍｏｔｅｒ??ａ??－２０００?－１５００?－１０００?－５００?０??Ｈ——－Ｈ－ｌｌｌ－ＩＨｆｒｉ－Ｈ｝１１??■?ＡＢＲＥ?｜?ＥＲＥ?｜?Ｗ－ｂｏｘ?屋?ＨＳＥ??ＴＣＡ－ｅｌｅｍｅｎｔ??ｂ?＾?ｉ?１?ＲＳＩ?ｉ?１?Ｍｏｃｋ??°?＾??－令?［．ｉ??１?４－?Ａ?ｉ?令?－４?ｉ
结果与分析??图３－４瞬间超表达对细胞死亡以及与免疫相关防御基因的表达??（ａ）通过ｒｃａｌ－ｔｉｉｎｃ?ＲＴ－ＰＣＲ检测表达效率。（ｂ）通过ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＲＴ－ＰＣＲ检测显性抑制子表达效??率。（ｃ）瞬间超表达３５Ｓ：：Ｃｒｔ（Ｗ？夂Ｆ７／引起的过敏反应，图中显示的分别为侵染４天后的白光??及ＵＶ灯下表型。分别采用ＤＡＢ染色和Ｔｒｙｐａｎ?ｂｌｕｅ染色两种组织化学染色方法检测瞬间超??表达３５Ｓ：：ＣＶ／Ｆ／？人Ｔ７／引起的细胞死亡和过氧化物积累。农杆菌注射３６ｈ和６０ｌｉ后，测电导??率。（ｄ）将含Ｃ？ｆＴＯＡＴ７／和空载体的农杆菌ＧＶ３１０１，?０Ｄ＿调至０．４，注射后不同时间点做??电导率测定。（ｅ）在辣椒叶片上瞬间超表达３５Ｓ：：ＣｆｌｆＷ？／Ｑ７７、３５Ｓ：：Ｃｆｌｆ＿ｒａ人７７／－５７仍１和??３５Ｓ：：（％／，分别于１２?ｈ，?２４?ｈ，?３６?ｈ后采样＿。通过ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＲＴ－ＰＣＲ检測与免疫和耐热性相关??标记基因的表达。用方差分析表示四个独立的生物学重复实验的數据。按照Ｆ测验保护最小??显著差数法的分析，极显著差异用不同的大写字母表示（户＜０．０１）？??Ｆｉｇ．３－４?Ｃｅｌｌ?ｄｅａｔｈ?ａｎｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ｉｍｍｕｎｉｔｙ?ｏｒ?ｔｈｅｍｉｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ?ｍａｒｋｅｒ?ｇｅｎｅｓ?ｗｅｒｅ??ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ?ｂｙ?ｔｒａｎｓｉｅｎｔ?ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＣｃｉＷＲＫＹ７１??（ａ）?Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＲＴ－ＰＣＲ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，?（ｂ）?Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＲＴ－ＰＣＲ?ａｎａｌｙｓ
【参考文献】：
期刊论文
[1]辣椒WRKY转录因子的鉴别及进化分析[J]. 刁卫平,王述彬,刘金兵,潘宝贵,郭广君,戈伟. 华北农学报. 2014(06)
[2]柽柳ThERF1基因上游调控因子W-box互作蛋白[J]. 臧丹丹,刘文进,王玉成. 东北林业大学学报. 2014(02)
博士论文
[1]棉花衰老相关WRKY基因的克隆与功能分析[D]. 窦玲玲.西北农林科技大学 2016
本文编号：3257031
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图３－１?（ａ）辣椒ＣａＷＲＫＹ７１与其他物种中同源性相对较高的蛋白的氨基酸序列比对
Ｃ．ａＷＲＫＹ７１及其－Ｌｊ?ＣａＷＲＫＹ４０互作在辣椒应答青枯保ｉ侵染中的作用??元件。其中含有多个ＨＳＥ应答相关元件，暗示了其与高温胁迫的关系，并含有??三个保守的Ｗ－ｂｏｘ，这一结果暗示了该基因的表达极有可能与多种植物激素有??关，并且在逆境处理以及其他的ＷＲＫＹ转录因子的作用下受到调控（图３－２ａ）。??通过提取８叶期辣椒幼苗在青枯菌接种１２?ｈ以及２４?ｌｉ叶片的ｍＲＮＡ，并通过反??转录ＰＣＲ制作成ｃＤＮＡ文库作为模板，通过实时荧光定量ＰＣＲ分析ＣＶ／．／０７／??对青枯菌侵染的应答水平，我们发现该基因对青枯菌侵染的应答明显，该基因??的表达量在丨２?ｈ以及２４?ｈ都发生很明显的提高（图３－２ｂ）。我们对８叶期辣椒幼??苗的叶片喷施外源植物激素，并于２４?ｈ对辣椒叶片进行采样，提取ＲＮＡ，并逆??转录成ｃＤＮＡ后用实时荧光定量ＰＣＲ测定在不同植物激素处理下的??表达水平，发现在外源激素ＳＡ和ＥＴＨ的作用下被激活，而对其他??激素无明显应答（图３－２ｃ）。以上结果表明Ｑ／ＷＷＦ７７能在青枯菌侵染下被激活，??表达量明显提高，并且应答的是由乙烯利以及水杨酸介导的信号通路，这意味??着ｃｗｒａ／ｒｙｖ／很可能在辣椒应答青枯菌胁迫的抗逆反应相关信号通路中起到一??定作用。??ＣａＷＲＫＹ７１?ｐｒｏｍｏｔｅｒ??ａ??－２０００?－１５００?－１０００?－５００?０??Ｈ——－Ｈ－ｌｌｌ－ＩＨｆｒｉ－Ｈ｝１１??■?ＡＢＲＥ?｜?ＥＲＥ?｜?Ｗ－ｂｏｘ?屋?ＨＳＥ??ＴＣＡ－ｅｌｅｍｅｎｔ??ｂ?＾?ｉ?１?ＲＳＩ?ｉ?１?Ｍｏｃｋ??°?＾??－令?［．ｉ??１?４－?Ａ?ｉ?令?－４?ｉ
结果与分析??图３－４瞬间超表达对细胞死亡以及与免疫相关防御基因的表达??（ａ）通过ｒｃａｌ－ｔｉｉｎｃ?ＲＴ－ＰＣＲ检测表达效率。（ｂ）通过ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＲＴ－ＰＣＲ检测显性抑制子表达效??率。（ｃ）瞬间超表达３５Ｓ：：Ｃｒｔ（Ｗ？夂Ｆ７／引起的过敏反应，图中显示的分别为侵染４天后的白光??及ＵＶ灯下表型。分别采用ＤＡＢ染色和Ｔｒｙｐａｎ?ｂｌｕｅ染色两种组织化学染色方法检测瞬间超??表达３５Ｓ：：ＣＶ／Ｆ／？人Ｔ７／引起的细胞死亡和过氧化物积累。农杆菌注射３６ｈ和６０ｌｉ后，测电导??率。（ｄ）将含Ｃ？ｆＴＯＡＴ７／和空载体的农杆菌ＧＶ３１０１，?０Ｄ＿调至０．４，注射后不同时间点做??电导率测定。（ｅ）在辣椒叶片上瞬间超表达３５Ｓ：：ＣｆｌｆＷ？／Ｑ７７、３５Ｓ：：Ｃｆｌｆ＿ｒａ人７７／－５７仍１和??３５Ｓ：：（％／，分别于１２?ｈ，?２４?ｈ，?３６?ｈ后采样＿。通过ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＲＴ－ＰＣＲ检測与免疫和耐热性相关??标记基因的表达。用方差分析表示四个独立的生物学重复实验的數据。按照Ｆ测验保护最小??显著差数法的分析，极显著差异用不同的大写字母表示（户＜０．０１）？??Ｆｉｇ．３－４?Ｃｅｌｌ?ｄｅａｔｈ?ａｎｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ｉｍｍｕｎｉｔｙ?ｏｒ?ｔｈｅｍｉｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ?ｍａｒｋｅｒ?ｇｅｎｅｓ?ｗｅｒｅ??ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ?ｂｙ?ｔｒａｎｓｉｅｎｔ?ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＣｃｉＷＲＫＹ７１??（ａ）?Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＲＴ－ＰＣＲ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，?（ｂ）?Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＲＴ－ＰＣＲ?ａｎａｌｙｓ
【参考文献】：
期刊论文
[1]辣椒WRKY转录因子的鉴别及进化分析[J]. 刁卫平,王述彬,刘金兵,潘宝贵,郭广君,戈伟. 华北农学报. 2014(06)
[2]柽柳ThERF1基因上游调控因子W-box互作蛋白[J]. 臧丹丹,刘文进,王玉成. 东北林业大学学报. 2014(02)
博士论文
[1]棉花衰老相关WRKY基因的克隆与功能分析[D]. 窦玲玲.西北农林科技大学 2016
本文编号：3257031
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