枸杞内生真菌Fusarium nematophilum NQ8GII4遗传化体系的建立及在宿主植中的定殖
发布时间：2021-07-08 19:13
内生真菌在植物抗生物和非生物胁迫中发挥着重要的作用,目前国内外对内生真菌的多样性、生态分布以及生态功能等方面的研究较多,而对内生真菌在植物中侵染定殖规律的报道较少。本研究以前期筛选的枸杞高活性拮抗内生真菌Fusarium nematophilum NQ8GII4为材料,通过单因素试验和响应面法优化NQ8GII4菌株原生质体制备条件;利用PEG介导原生质体转化法,构建GFP标记的NQ8GII4菌株遗传转化体系;通过表型、拮抗活性、致病性、荧光强度以及PCR检测,筛选与野生型相当的转化子;在此基础上,利用GFP标记的NQ8GII4转化子发酵液灌根处理枸杞植株,明确NQ8GII4菌株在枸杞中的定殖情况及对枸杞促生抗病的影响。研究结果如下:1、通过单因素试验考察菌龄（12～20 h）、酶解时间（0.5～3 h）、酶质量浓度（15～35 g/L崩溃酶+10 g/L溶壁酶）、稳渗剂浓度（0.6～1.2 mol/L NaCl）等4个因素对NQ8GII4菌株原生质体产量、再生率和有效原生质体量的影响。采用3因素3水平的Box-Behnken响应面试验优化原生质体制备和再生条件。结果表明,确定酶解时间,...
【文章来源】：宁夏大学宁夏回族自治区 211工程院校
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－５各因素交互作用对枸杞内生真菌ＮＱ８ＧＩＩ４菌株原生质体产量（Ａ，？Ａ３）、再生率（Ｂ＾Ｂ；）、有效原生质??体量（Ｃｉ？Ｃ３）影响的响应面图??Ｆｉｇ．２－５?Ｒｅｓｐｏｎｓｅ?ｓｕｒｆａｃｅ?ｇｒａｐｈｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｖａｒｉｏｕｓ?ｆａｃｔｏｒｓ?ａｎｄ?ｔｈｅｉｒ?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?ｙｉｅｌｄ?（Ａｉ－Ａｓ）．??ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?ｒａｔｅ?（Ｂ１－Ｂ３），?ａｖａｉｌａｂｌｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?
量浓度为??３０．３０?ｇ／Ｌ的崩溃酶＋１０?ｇ／Ｌ溶壁酶的混合酶液中酶解２．５?ｈ。在此条件下进行５次试验，结果显??示优化后ＮＱ８ＧＩＩ４菌株原生质体平均产量可以达到７．１２Ｘ?１〇７个／ｍＬ，与预测值６．８１?Ｘ?１〇７个／ｍＬ??相差４．５６％；再生率平均为５．５６％，与预测值５．６７％相差１．９８％；有效原生质体量平均为??３９．５９Ｘ?１０５个／ｍＬ，与预测值３８．５３Ｘ１０５个／ｍＬ相差２．７５％。证明该模型是可靠的。优化后产生??的原生质体大小均匀，球体圆润，菌丝很少（图２－６），可以进行下一步试验。??１＿?＿??图２－６?ＮＱ８ＧＩＩ４菌丝和原生质体??Ｆｉｇ．２－６?Ｈｙｐｈａｅ?ａｎｄ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?ｏｆ?ＮＱ８ＧＩＩ４?ｓｔｒａｉｎ??注：Ａ：萌发１６ｈ的枸杞内生真菌ＮＱ８ＧＩＩ４蘭株菌丝体；Ｂ：枸杞内生真菌ＮＱ８ＧＩＩ４菌株原生质体；Ｃ：枸杞内生真菌ＮＱ８ＧＩＩ４菌??株原生质体再生．标尺＝５０?ｐｍ．??Ｎｏｔｅ：?Ａ：?Ｇｅｎｎｉｎａｔｅｄ?ｃｏｎｉｄｉａ?ｏｆＮＱ８ＧＩＩ４?ｓｔｒａｉｎ?ｆｏｒ?１６?ｌｉ；?Ｂ：?Ｔｈｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?ｏｆＮＱ８ＧＩＩ４?ｓｔｒａｉｎ；?Ｃ：?Ｔｈｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?ｒｅｇｅｎｅｒａｌｉｏｎ?ｏｆＮＱ８ＧＵ４??ｓｔｒａｉｎ．?Ｂａｒｓ＝５０｜．ｉｍ．??２．４讨论??原生质体制备与再生是两个相互联系的过程，原生质体的产量和再生率是评价原生质体制??备质量的评价指标［ＳＱ］。获得一定浓度、纯度和活力的原生质体是进行分子遗传学操作的基础和??前提保障之一［ｍ］。关于丝状真菌原生质体制备国内外己有不少的研宄报道，但是由于细胞壁结??构较为
宁夏大学硕士学位论文?第三章枸杞拮抗内生真菌ＮＱ８Ｇ１１４菌株ＧＦＰ标签蛋白表达载体的筛选??图３－３?４种转化子菌落特征??Ｆｉｇ．３－３?Ｔｈｅ?ｃｏｌｏｎｉｅｓ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ?ｏｆ?４?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ??Ａ：表达载体ｐＦＬ２拟转化子；Ｂ：表达载体ｐＤＬ２拟转化子；Ｃ：表达载体ｒ－ＫＮＴ拟转化子；Ｄ：表达载体ＫＮＴＧ拟转化子．??Ａ：?ｐＦＬ２?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ；?Ｂ：?ｐＤＬ２?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ：?Ｃ：?ｒ－ＫＮＴ?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ；?Ｃ：?ＫＮＴＧ?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ．??３．３．３?ＮＱ８ＧＩＩ４菌株转化子的ＰＣＲ检测??随机挑取在３０?ｍｇ／Ｌ?ＨｍＢ或１００?ｍｇ／Ｌ?Ｇ４］?８上生长良好的菌落，分别提取菌丝体ＤＮＡ进行??ＰＣＲ扩増，ｐＦＬ２?（图３４?Ａ）和ｐＤＬ２?（图３４?Ｂ）转化子均可以扩增出５００ｂｐ左右的目的条带，??ｒ－ＫＮＴ?（图３－４?Ｃ）和ＫＮＴＧ转化子（图３－４?Ｄ）均可以扩増出７００?ｂｐ左右的目的条带，与表达??载体扩增出的条带相同，而野生型ＮＱ８Ｇ１Ｉ４菌株均未扩增出目的条带。说明ｇ办基因已经被成??功整合到了?ＮＱ８ＧＩＩ４菌株基因组中。??ＰＭ?Ｉ?２?３?４?５?６?ＷＴ?Ｍｌ?２?３４５?６?７８?９１０Ｉ１Ｉ２ＰＷＴ??ｉ〇〇ｂｐ??Ｍｌ?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?Ｊ５?Ｐ?ＷＴ??５〇０ｂｐ?７００ｂｐ??２５０ｂｐ??１〇ｕｂｐ?：胃??Ｍ?＼?２?３?４?５?６?７?８
【参考文献】：
期刊论文
[1]近红外高光谱图像的宁夏枸杞产地鉴别[J]. 王磊,覃鸿,李静,张小波,于丽娜,李卫军,黄璐琦. 光谱学与光谱分析. 2020(04)
[2]利用绿色荧光蛋白GFP研究不同启动子在蝉棒束孢菌中的表达活性[J]. 李栋,刘常利,刘靖宇,孟俊龙,王洪凯. 食用菌学报. 2020(01)
[3]枸杞内生真菌对胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的拮抗作用及生防潜力[J]. 胡丽杰,闫思远,李嘉泓,杜娟,顾沛雯. 植物保护. 2020(01)
[4]枸杞Lb14-3-3c基因克隆及转化马铃薯的研究[J]. 张兴,周丽,乔亚蕊,徐蕊,岳思君,杨淑娟,姚新灵,杨立明,郑蕊. 植物遗传资源学报. 2019(06)
[5]甘肃省枸杞炭疽病菌对4种甾醇脱甲基抑制剂的敏感性[J]. 张海英,刘永刚,李建军,张新瑞. 农药学学报. 2019(04)
[6]辣椒胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立[J]. 曾泉,满益龙,陈岳,张鑫,张卓,李成刚,杜娇,张德咏,刘勇,谭新球. 植物保护. 2019(04)
[7]基于CRISPR-Cas9技术构建橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统[J]. 郭燕华,安邦. 微生物学通报. 2020(01)
[8]娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液对小麦幼苗的促生作用[J]. 谢玉琴,马丹丹,杨树,李培,徐秉良,薛应钰. 西北农业学报. 2019(08)
[9]芸薹生链格孢致病缺陷突变体的筛选及初步分析[J]. 张晓斐,刘伟阳,卢凯,张敏,徐后娟. 基因组学与应用生物学. 2019(06)
[10]稻镰状瓶霉对水稻白叶枯病的生物防治[J]. 苏珍珠,冯晓晓,汪彦欣,刘小红,章初龙,林福呈. 菌物学报. 2019(06)
博士论文
[1]野大麦内生真菌提高宿主耐盐性的生理机制研究[D]. 陈泰祥.兰州大学 2019
[2]黄土高原丛枝菌根真菌（AMF）提高刺槐抗旱性机制[D]. 何斐.西北农林科技大学 2016
[3]内生真菌间座壳属多样性、无柄盘菌代谢产物及炭角菌与植物互作研究[D]. 王佳莹.浙江大学 2015
[4]暗色有隔内生真菌稻镰状瓶霉（Harpophora oryzae）与水稻互惠共生机制的研究[D]. 苏珍珠.浙江大学 2012
硕士论文
[1]葡萄灰霉菌产孢类群划分及其生物防治研究[D]. 王忠兴.宁夏大学 2019
[2]棘孢木霉和撕裂蜡孔菌共接种对大豆促生机理的研究[D]. 柳丹华.郑州大学 2018
[3]白喉乌头内生真菌的分离、鉴定及抗菌活性的研究[D]. 玛依拉·吐尔地别克.吉首大学 2017
[4]宁夏枸杞内生真菌多样性及其生防作用评价[D]. 徐全智.宁夏大学 2017
[5]钩状木霉的绿色荧光蛋白标记体系构建及其对辣椒的促生和疫霉病害的生防作用[D]. 赵兴丽.贵州师范大学 2017
[6]核桃高活性内生真菌筛选及其代谢产物抑菌活性的研究[D]. 刘泽星.西北农林科技大学 2017
[7]碱蓬内生真菌JP4-1的筛选、鉴定及促生活性研究[D]. 于飞.沈阳师范大学 2016
[8]PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola原生质体转化体系的研究[D]. 韩小路.西北农林科技大学 2015
[9]4株生防菌对番茄灰霉病的防治及改良菌株F1-35的GFP标记研究[D]. 甘良.西北农林科技大学 2015
[10]模拟取食和刈割对感染内生真菌的羽茅抗虫性影响研究[D]. 秦俊华.南开大学 2015
本文编号：3272168
【文章来源】：宁夏大学宁夏回族自治区 211工程院校
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－５各因素交互作用对枸杞内生真菌ＮＱ８ＧＩＩ４菌株原生质体产量（Ａ，？Ａ３）、再生率（Ｂ＾Ｂ；）、有效原生质??体量（Ｃｉ？Ｃ３）影响的响应面图??Ｆｉｇ．２－５?Ｒｅｓｐｏｎｓｅ?ｓｕｒｆａｃｅ?ｇｒａｐｈｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｖａｒｉｏｕｓ?ｆａｃｔｏｒｓ?ａｎｄ?ｔｈｅｉｒ?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?ｙｉｅｌｄ?（Ａｉ－Ａｓ）．??ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?ｒａｔｅ?（Ｂ１－Ｂ３），?ａｖａｉｌａｂｌｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?
量浓度为??３０．３０?ｇ／Ｌ的崩溃酶＋１０?ｇ／Ｌ溶壁酶的混合酶液中酶解２．５?ｈ。在此条件下进行５次试验，结果显??示优化后ＮＱ８ＧＩＩ４菌株原生质体平均产量可以达到７．１２Ｘ?１〇７个／ｍＬ，与预测值６．８１?Ｘ?１〇７个／ｍＬ??相差４．５６％；再生率平均为５．５６％，与预测值５．６７％相差１．９８％；有效原生质体量平均为??３９．５９Ｘ?１０５个／ｍＬ，与预测值３８．５３Ｘ１０５个／ｍＬ相差２．７５％。证明该模型是可靠的。优化后产生??的原生质体大小均匀，球体圆润，菌丝很少（图２－６），可以进行下一步试验。??１＿?＿??图２－６?ＮＱ８ＧＩＩ４菌丝和原生质体??Ｆｉｇ．２－６?Ｈｙｐｈａｅ?ａｎｄ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?ｏｆ?ＮＱ８ＧＩＩ４?ｓｔｒａｉｎ??注：Ａ：萌发１６ｈ的枸杞内生真菌ＮＱ８ＧＩＩ４蘭株菌丝体；Ｂ：枸杞内生真菌ＮＱ８ＧＩＩ４菌株原生质体；Ｃ：枸杞内生真菌ＮＱ８ＧＩＩ４菌??株原生质体再生．标尺＝５０?ｐｍ．??Ｎｏｔｅ：?Ａ：?Ｇｅｎｎｉｎａｔｅｄ?ｃｏｎｉｄｉａ?ｏｆＮＱ８ＧＩＩ４?ｓｔｒａｉｎ?ｆｏｒ?１６?ｌｉ；?Ｂ：?Ｔｈｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?ｏｆＮＱ８ＧＩＩ４?ｓｔｒａｉｎ；?Ｃ：?Ｔｈｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ?ｒｅｇｅｎｅｒａｌｉｏｎ?ｏｆＮＱ８ＧＵ４??ｓｔｒａｉｎ．?Ｂａｒｓ＝５０｜．ｉｍ．??２．４讨论??原生质体制备与再生是两个相互联系的过程，原生质体的产量和再生率是评价原生质体制??备质量的评价指标［ＳＱ］。获得一定浓度、纯度和活力的原生质体是进行分子遗传学操作的基础和??前提保障之一［ｍ］。关于丝状真菌原生质体制备国内外己有不少的研宄报道，但是由于细胞壁结??构较为
宁夏大学硕士学位论文?第三章枸杞拮抗内生真菌ＮＱ８Ｇ１１４菌株ＧＦＰ标签蛋白表达载体的筛选??图３－３?４种转化子菌落特征??Ｆｉｇ．３－３?Ｔｈｅ?ｃｏｌｏｎｉｅｓ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ?ｏｆ?４?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ??Ａ：表达载体ｐＦＬ２拟转化子；Ｂ：表达载体ｐＤＬ２拟转化子；Ｃ：表达载体ｒ－ＫＮＴ拟转化子；Ｄ：表达载体ＫＮＴＧ拟转化子．??Ａ：?ｐＦＬ２?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ；?Ｂ：?ｐＤＬ２?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ：?Ｃ：?ｒ－ＫＮＴ?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ；?Ｃ：?ＫＮＴＧ?ｐｕｔａｔｉｖｅ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ．??３．３．３?ＮＱ８ＧＩＩ４菌株转化子的ＰＣＲ检测??随机挑取在３０?ｍｇ／Ｌ?ＨｍＢ或１００?ｍｇ／Ｌ?Ｇ４］?８上生长良好的菌落，分别提取菌丝体ＤＮＡ进行??ＰＣＲ扩増，ｐＦＬ２?（图３４?Ａ）和ｐＤＬ２?（图３４?Ｂ）转化子均可以扩增出５００ｂｐ左右的目的条带，??ｒ－ＫＮＴ?（图３－４?Ｃ）和ＫＮＴＧ转化子（图３－４?Ｄ）均可以扩増出７００?ｂｐ左右的目的条带，与表达??载体扩增出的条带相同，而野生型ＮＱ８Ｇ１Ｉ４菌株均未扩增出目的条带。说明ｇ办基因已经被成??功整合到了?ＮＱ８ＧＩＩ４菌株基因组中。??ＰＭ?Ｉ?２?３?４?５?６?ＷＴ?Ｍｌ?２?３４５?６?７８?９１０Ｉ１Ｉ２ＰＷＴ??ｉ〇〇ｂｐ??Ｍｌ?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?Ｊ５?Ｐ?ＷＴ??５〇０ｂｐ?７００ｂｐ??２５０ｂｐ??１〇ｕｂｐ?：胃??Ｍ?＼?２?３?４?５?６?７?８
【参考文献】：
期刊论文
[1]近红外高光谱图像的宁夏枸杞产地鉴别[J]. 王磊,覃鸿,李静,张小波,于丽娜,李卫军,黄璐琦. 光谱学与光谱分析. 2020(04)
[2]利用绿色荧光蛋白GFP研究不同启动子在蝉棒束孢菌中的表达活性[J]. 李栋,刘常利,刘靖宇,孟俊龙,王洪凯. 食用菌学报. 2020(01)
[3]枸杞内生真菌对胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的拮抗作用及生防潜力[J]. 胡丽杰,闫思远,李嘉泓,杜娟,顾沛雯. 植物保护. 2020(01)
[4]枸杞Lb14-3-3c基因克隆及转化马铃薯的研究[J]. 张兴,周丽,乔亚蕊,徐蕊,岳思君,杨淑娟,姚新灵,杨立明,郑蕊. 植物遗传资源学报. 2019(06)
[5]甘肃省枸杞炭疽病菌对4种甾醇脱甲基抑制剂的敏感性[J]. 张海英,刘永刚,李建军,张新瑞. 农药学学报. 2019(04)
[6]辣椒胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立[J]. 曾泉,满益龙,陈岳,张鑫,张卓,李成刚,杜娇,张德咏,刘勇,谭新球. 植物保护. 2019(04)
[7]基于CRISPR-Cas9技术构建橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统[J]. 郭燕华,安邦. 微生物学通报. 2020(01)
[8]娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液对小麦幼苗的促生作用[J]. 谢玉琴,马丹丹,杨树,李培,徐秉良,薛应钰. 西北农业学报. 2019(08)
[9]芸薹生链格孢致病缺陷突变体的筛选及初步分析[J]. 张晓斐,刘伟阳,卢凯,张敏,徐后娟. 基因组学与应用生物学. 2019(06)
[10]稻镰状瓶霉对水稻白叶枯病的生物防治[J]. 苏珍珠,冯晓晓,汪彦欣,刘小红,章初龙,林福呈. 菌物学报. 2019(06)
博士论文
[1]野大麦内生真菌提高宿主耐盐性的生理机制研究[D]. 陈泰祥.兰州大学 2019
[2]黄土高原丛枝菌根真菌（AMF）提高刺槐抗旱性机制[D]. 何斐.西北农林科技大学 2016
[3]内生真菌间座壳属多样性、无柄盘菌代谢产物及炭角菌与植物互作研究[D]. 王佳莹.浙江大学 2015
[4]暗色有隔内生真菌稻镰状瓶霉（Harpophora oryzae）与水稻互惠共生机制的研究[D]. 苏珍珠.浙江大学 2012
硕士论文
[1]葡萄灰霉菌产孢类群划分及其生物防治研究[D]. 王忠兴.宁夏大学 2019
[2]棘孢木霉和撕裂蜡孔菌共接种对大豆促生机理的研究[D]. 柳丹华.郑州大学 2018
[3]白喉乌头内生真菌的分离、鉴定及抗菌活性的研究[D]. 玛依拉·吐尔地别克.吉首大学 2017
[4]宁夏枸杞内生真菌多样性及其生防作用评价[D]. 徐全智.宁夏大学 2017
[5]钩状木霉的绿色荧光蛋白标记体系构建及其对辣椒的促生和疫霉病害的生防作用[D]. 赵兴丽.贵州师范大学 2017
[6]核桃高活性内生真菌筛选及其代谢产物抑菌活性的研究[D]. 刘泽星.西北农林科技大学 2017
[7]碱蓬内生真菌JP4-1的筛选、鉴定及促生活性研究[D]. 于飞.沈阳师范大学 2016
[8]PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola原生质体转化体系的研究[D]. 韩小路.西北农林科技大学 2015
[9]4株生防菌对番茄灰霉病的防治及改良菌株F1-35的GFP标记研究[D]. 甘良.西北农林科技大学 2015
[10]模拟取食和刈割对感染内生真菌的羽茅抗虫性影响研究[D]. 秦俊华.南开大学 2015
本文编号：3272168
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