与南方水稻黑条矮缩病毒P10蛋白互作的寄主因子筛选及其对叶绿体结构与功能影响的研究
发布时间：2021-07-21 23:25
南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）是由介体白背飞虱（Sogatella furcifera,WBPH）进行传播的一种双链RNA病毒,侵染水稻后植株严重矮缩,严重影响作物产量。目前,关于外壳蛋白P10在病毒侵染寄主水稻中的作用机制并不清楚。因此本研究通过酵母双杂系统筛选与P10互作的寄主因子,进一步研究这种互作关系在SRBSDV侵染过程中发挥怎样的作用。本研究利用酵母双杂交技术,构建诱饵质粒p BT3-SUC-P10,利用酵母DUAL膜体系（DUAL membrane system）以水稻c DNA文库为模板筛选与P10互作的寄主因子。进一步对筛选到的阳性克隆进行分析后,挑选3个与叶绿体相关的蛋白,并对其进行回转验证,证明其在酵母中发生互作。利用免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation,Co-IP）技术在烟草瞬时表达系统中证实了Os PS1-L、Os PT3、Os LPA1与P10发生相互作用。在烟草表皮细胞中的亚细胞定位结果表明P10蛋白与Os PS1-L定位在叶绿体和细胞质上,与Os P...
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SRBSDV的病毒粒子[11]
中加入 100 μL 含有氨苄霉素抗性的 LB 液体培养基；（7）37 ℃，220 r min-1 震荡培养 3 h，进行菌落 PCR，挑选有条带的样品吸取 50 μL 送公司测序。2.3 结果与分析2.3.1 RT-PCR 扩增 P10 全长以 SRBSDV 侵染的水稻 c DNA 为模板，利用特异引物（表 2-1）对目的基因进行 RT-PCR 扩增，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后，约在 1700 bp 处出现与目的基因大小一致的条带，电泳图如 2-1 所示：
与南方水稻黑条矮缩病毒P10蛋白互作的寄主因子筛选及其对叶绿体结构与功能影响的研究172.3.2诱饵表达载体的构建膜系统酵母表达载体pBT3-STE、pBT3-SUC和pBT3-N在Sfi1酶切位点进行酶切后，与P10PCR产物一起切胶回收，二者连接后转入大肠杆菌感受态DH5α中，热激孵育后涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养后，挑取阳性克隆于含有卡那霉素抗性的LB液体培养基进行培养，菌落PCR结果如图2-2，送公司测序。测序结果与P10序列比对成功后，提取对应菌液质粒并酶切鉴定，结果如图2-3所示，构建的诱饵质粒经酶切后在1700bp处有目标条带，表明P10成功连建到了膜系统酵母表达载体pBT3-STE、pBT3-SUC和pBT3-N上。图2-2PCR检测诱饵载体阳性克隆Fig.2-2PCRdetectionofbaitvectorpositiveclones图2-3诱饵质粒酶切鉴定Fig.2-3Identificationofbaitplasmiddigestion2.3.3酵母膜系统功能验证在检测膜蛋白酵母双杂交系统的功能时，如果诱饵蛋白在酵母细胞内具有表达功能，便会依据诱饵蛋白的表达水平在SD-Trp/Leu/His和SD-Ade/His/Leu/Trp筛选平板上有10%-100%的生长率。而自激活检测的SD-Trp/Leu/His和SD-Ade/His/Leu/Trp筛选平板上，应观察不到显著的生长。在阳性对照的表2-2反应1中，pTSU2-APP与pNubG-Fe65具有强相互作用，而作为阴性对照的pTSU2-APP与pPR3N在SD-Trp/Leu/His和SD-Ade/His/Leu/Trp筛选平板上的生长显著少于阳性对照。检测诱饵基因功能时发现载体pBT3-N-P10在SD-THL筛选平板上生长较好但在SD-Ade/His/Leu/Trp筛选平板上生长较少，而pBT3-
本文编号：3295971
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SRBSDV的病毒粒子[11]
中加入 100 μL 含有氨苄霉素抗性的 LB 液体培养基；（7）37 ℃，220 r min-1 震荡培养 3 h，进行菌落 PCR，挑选有条带的样品吸取 50 μL 送公司测序。2.3 结果与分析2.3.1 RT-PCR 扩增 P10 全长以 SRBSDV 侵染的水稻 c DNA 为模板，利用特异引物（表 2-1）对目的基因进行 RT-PCR 扩增，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后，约在 1700 bp 处出现与目的基因大小一致的条带，电泳图如 2-1 所示：
与南方水稻黑条矮缩病毒P10蛋白互作的寄主因子筛选及其对叶绿体结构与功能影响的研究172.3.2诱饵表达载体的构建膜系统酵母表达载体pBT3-STE、pBT3-SUC和pBT3-N在Sfi1酶切位点进行酶切后，与P10PCR产物一起切胶回收，二者连接后转入大肠杆菌感受态DH5α中，热激孵育后涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养后，挑取阳性克隆于含有卡那霉素抗性的LB液体培养基进行培养，菌落PCR结果如图2-2，送公司测序。测序结果与P10序列比对成功后，提取对应菌液质粒并酶切鉴定，结果如图2-3所示，构建的诱饵质粒经酶切后在1700bp处有目标条带，表明P10成功连建到了膜系统酵母表达载体pBT3-STE、pBT3-SUC和pBT3-N上。图2-2PCR检测诱饵载体阳性克隆Fig.2-2PCRdetectionofbaitvectorpositiveclones图2-3诱饵质粒酶切鉴定Fig.2-3Identificationofbaitplasmiddigestion2.3.3酵母膜系统功能验证在检测膜蛋白酵母双杂交系统的功能时，如果诱饵蛋白在酵母细胞内具有表达功能，便会依据诱饵蛋白的表达水平在SD-Trp/Leu/His和SD-Ade/His/Leu/Trp筛选平板上有10%-100%的生长率。而自激活检测的SD-Trp/Leu/His和SD-Ade/His/Leu/Trp筛选平板上，应观察不到显著的生长。在阳性对照的表2-2反应1中，pTSU2-APP与pNubG-Fe65具有强相互作用，而作为阴性对照的pTSU2-APP与pPR3N在SD-Trp/Leu/His和SD-Ade/His/Leu/Trp筛选平板上的生长显著少于阳性对照。检测诱饵基因功能时发现载体pBT3-N-P10在SD-THL筛选平板上生长较好但在SD-Ade/His/Leu/Trp筛选平板上生长较少，而pBT3-
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