家蚕微孢子虫烯醇化酶的表达特性分析及亚细胞定位

发布时间：2021-08-20 05:45

　　新陈代谢是生命体生命活动的基础,是物质代谢和能量代谢的结合。微孢子虫是细胞内寄生的真核生物,宿主域广泛,寄生环境的复杂多样使得不同种属的微孢子虫的代谢情况存在很大的差异。对微孢子虫的基因组分析发现其基因组中编码蛋白的序列在长度和数量上都有着很大程度的缩减,尤其是与代谢相关的基因,因此微孢子虫的代谢研究一直是学者关注的热点。对家蚕微孢子虫的基因组分析发现家蚕微孢子虫拥有完整的糖酵解途径,能够通过该途径获取生命活动所需的部分能量。烯醇化酶（Enolase,ENO）是糖酵解过程中的限速酶,对烯醇化酶的研究能够为我们更好地了解微孢子虫的能量代谢提供一定的基础。且近年来也有烯醇化酶新的功能的发现报道,因此烯醇化酶在家蚕微孢子虫的生命活动中是否参与到其他的过程当中也是我们关注的问题。本研究依据微孢子虫数据库中家蚕微孢子虫烯醇化酶的编码序列设计引物,以家蚕微孢子虫DNA为模板PCR扩增获得家蚕微孢子虫烯醇化酶基因NbENO。生物信息学分析结果显示该基因ORF全长1239 bp,编码413个氨基酸,预测蛋白质分子质量46.323 kD,等电点6.13;蛋白质二级结构主要由α螺旋（28.33%）、延伸片... 

【文章来源】：江苏科技大学江苏省

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 绪论
    1.1 微孢子虫的研究进展
        1.1.1 微孢子虫概述
        1.1.2 微孢子虫的基因组学研究
        1.1.3 微孢子虫蛋白质的研究
        1.1.4 微孢子虫代谢的研究
    1.2 烯醇化酶的研究进展
    1.3 研究意义及内容
    1.4 研究路线
第2章 家蚕微孢子虫烯醇化酶基因NbENO的克隆与序列分析
    2.1 前言
    2.2 实验材料
        2.2.1 材料与试剂
        2.2.2 主要仪器设备
        2.2.3 主要试剂配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 家蚕微孢子虫基因组ＤＮＡ的提取
        2.3.2 家蚕微孢子虫烯醇化酶基因NbENO的克隆
        2.3.3 制备大肠埃希氏菌Top 10 感受态细胞
        2.3.4 重组质粒pMD-19T-NbENO的构建及序列测序
        2.3.5 烯醇化酶基因NbENO及编码蛋白的生物信息学分析
    2.4 结果与分析
        2.4.1 家蚕微孢子虫烯醇化酶基因NbENO的克隆
        2.4.2 NbENO基因及蛋白序列分析
    2.5 讨论
第3章 家蚕微孢子虫烯醇化酶NbENO的原核表达以及抗体制备
    3.1 前言
    3.2 实验材料
        3.2.1 材料与试剂
        3.2.2 主要仪器设备
        3.2.3 主要试剂配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 NbENO基因的扩增
        3.3.2 原核表达载体pET-28a-NbENO的构建及鉴定
        3.3.3 NbENO重组蛋白的表达与鉴定
        3.3.4 重组蛋白NbENO的表达纯化
        3.3.5 NbENO多克隆抗体的制备
    3.4 结果与分析
        3.4.1 原核表达载体pET-28a-NbENO的构建及鉴定
        3.4.2 NbENO重组蛋白的表达与鉴定及纯化
        3.4.3 重组蛋白NbENO多克隆抗体的制备
    3.5 讨论
第4章 家蚕微孢子虫NbENO在侵染家蚕过程中的表达特征分析
    4.1 前言
    4.2 实验材料
        4.2.1 材料与试剂
        4.2.2 主要仪器设备
        4.2.3 主要试剂配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 家蚕微孢子虫感染家蚕后不同时间点的中场组织取样
        4.3.2 家蚕微孢子虫感染家蚕BmN细胞不同时间点取样
        4.3.3 家蚕微孢子虫感染样品的总RNA提取
        4.3.4 反转录反应
        4.3.5 NbENO不同时间点的表达情况检测
    4.4 结果与分析
        4.4.1 NbENO表达的半定量检测
        4.4.2 NbENO在家蚕微孢子虫侵染家蚕的不同时期的表达情况分析
    4.5 讨论
第5章 家蚕微孢子虫烯醇化酶NbENO的亚细胞定位
    5.1 前言
    5.2 实验材料
        5.2.1 材料与试剂
        5.2.2 主要仪器设备
        5.2.3 主要试剂配制
    5.3 实验方法
        5.3.1 家蚕微孢子虫的Percoll纯化
        5.3.2 家蚕微孢子虫发芽处理
        5.3.3 间接免疫荧光实验
    5.4 结果与分析
        5.4.1 家蚕微孢子虫的Percoll纯化与发芽处理
        5.4.2 NbENO在家蚕微孢子虫孢子中的间接免疫荧光定位
    5.5 讨论
结论
参考文献
附录
攻读硕士期间发表的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]微孢子虫极管蛋白的研究进展[J]. 龙梦娴,吴玉娇,陈洁,潘国庆,李春峰,李田,陈果,周泽扬.  蚕业科学. 2014(05)
[2]烯醇化酶与寄生虫感染[J]. 高玒,余传信.  中国血吸虫病防治杂志. 2014(04)
[3]烯醇化酶1的生物学功能[J]. 姜冬梅,康波,马容,何珲.  动物营养学报. 2014(01)
[4]温度对家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）孢子体外发芽的影响[J]. 黄旭华,朱方容,潘志新,汤庆坤,罗梅兰,罗坚,陈小青,黄深惠.  南方农业学报. 2013(06)
[5]烯醇化酶在病原生物侵染寄主中的作用[J]. 刘华,曾洪梅,邱德文.  中国生物防治学报. 2012(01)
[6]一种快速高效制备家蚕微孢子虫基因组DNA和总蛋白的方法[J]. 蔡顺风,何欣怡,何祥康,邱海洪,李光才,何永强,鲁兴萌.  蚕业科学. 2011(06)
[7]微孢子虫蛋白质及其与宿主互作的研究进展[J]. 吴正理,李艳红,宋元达.  蚕业科学. 2009(04)
[8]家蚕微孢子虫在家蚕胚胎细胞系BmE-SWU1中的极丝弹出情况[J]. 李艳红,吴正理,潘国庆,庞敏,胡军华,张瑞芝,周泽扬.  动物学报. 2007(06)
[9]家蚕微孢子虫N.bombycis分离纯化方法的优化[J]. 周成,潘国庆,万永继,周泽扬.  蚕学通讯. 2002(01)

博士论文
[1]家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究[D]. 林立鹏.西南大学 2012

硕士论文
[1]家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究[D]. 马成.西南大学 2012



本文编号：3352932