Q烟粉虱与TYLCV互作蛋白的筛选及其ABC转运蛋白的分析
发布时间：2021-09-15 16:42
烟粉虱作为一种世界性害虫,不仅可取食为害植物,还可传播植物病毒病,并且极易对杀虫剂产生抗药性,这使得烟粉虱拥有极强的适应性,成为农业生产的重大威胁。番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）是菜豆金色花叶病毒属的代表种,引起的病毒病是全球番茄生产上最重要的病害之一,TYLCV由烟粉虱特异性传播,研究二者的互作对于解析烟粉虱的传毒机制十分关键。ABC转运蛋白是一类多功能的基因超家族,作为昆虫代谢抗性中的新成员,ABC转运蛋白在昆虫研究中备受关注。如今关于烟粉虱传毒机制依然知之甚少,也没有烟粉虱全基因组水平的ABC转运蛋白的报道,所以,探索TYLCV与烟粉虱的互作以及完成ABC转运蛋白的鉴定和分析,可以帮助我们了解烟粉虱的传毒机制和抗逆性机制,解释烟粉虱强大的入侵性并指导害虫防治工作。本论文通过泛素化的酵母膜系统对TYLCV与烟粉虱的互作展开研究,首先成功构建了用于酵母双杂交的烟粉虱cDNA文库,利用TYLCV的外壳蛋白（CP）作为诱饵,首次成功从烟粉虱cDNA文库中筛选得到了80个阳性克隆,进一步利用该系统对这些候选蛋白与CP的互作进行验证,明确了20个烟粉虱蛋白与CP发生互作。在酵母双杂交得到的抗...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：110 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
TYLCV基因组结构图（Gronenborn,2007）
能的重要途径，目前酵母双杂交、双分子荧光互补、pull-down、免疫共沉淀、噬菌都可用于蛋白质互作研究，其中，酵母双杂交是一种操作相对简单、成本低且十分该技术已经被广泛应用于基因的表达与调控、信号传导等领域的研究中。母双杂交原理双杂交系统最早是 Field 等人在 1989 年建立起来的，主要是用于明确蛋白之间相方法（Fields et al., 1989）。真核生物转录激活因子一般由两个结构上可以分割且功域组成，其中，酿酒酵母的转录因子包括转录激活域（Transcriptional activation dNA 结合域（DNA-binding domain, BD）（Uetz，2012），BD 可以识别并结合转录激操纵子结构，AD 通过与转录因子结合来启动下游基因，只有当 AD 和 BD 结合后用，启动下游基因转录，酵母双杂交技术就是利用这一特点开发而来的。当两个待于 AD 和 BD 结合，构成的两个融合载体分别称为猎物载体和诱饵载体，两个重组株中得到表达，只有两个待测蛋白可以发生互作时，AD 和 BD 才可以在空间位置合，进而激活下游靶标基因的转录和翻译表达。目前，通过基因工程工具，已经成改造为有直观表症的报告基因，这样，通过报告基因能否正常表达可以直接判定两否有互作关系。
业科学院博士学位论文 第一章 引组成的小分子蛋白质，常作为一种信号组分与其它蛋白质相连，可被一种专一化的蛋白quitin specific protease, UBP）所识别并将与其相连的蛋白质切割下来。根据泛素的结构特点功能不变的前提下，将其分为 C 端（C terminal part of ubiquitin, Cub）和 N 端（N termif ubiquitin, Nub）的两部分（Kittanakom et al., 2009）；然后把 Nub 的第 13 位氨基酸突变（NubG），这样 Cub 和 Nub 就不能正常结合成为泛素，而 Cub 仍可以与-LexA-VP16 进UBP 也就不能识别并水解与之结合的-LexA-VP16，下游报告基因的转录不能被激活，不到报告基因。将待检测的两个蛋白质分别于 C 端和 N 端连接并在酵母中融合表达，蛋白可以互作，则会使分离的 NubG 和 Cub 空间拉近而结合形成完整的泛素，于是与之LexA-VP16 蛋白就可以被 UBP 水解下来，进而激活下游报告基因。所以，通过检测下游就可以判定待检测两个蛋白是否发生了互作。
【参考文献】：
期刊论文
[1]我国棉花主产区棉蚜对吡虫啉的抗性监测及抗性机理[J]. 崔丽,张靖,齐浩亮,王芹芹,陆宴辉,芮昌辉. 昆虫学报. 2016(11)
[2]病毒蛋白质相互作用的研究方法及其应用[J]. 郭舒杨,周旭,国泰. 微生物学免疫学进展. 2011(01)
[3]灰飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建及分析[J]. 肖冬来,邓慧颖,谢荔岩,吴祖建,谢联辉. 植物保护. 2011(01)
[4]中国番茄黄化曲叶病毒在云南的发生分布及其遗传多样性[J]. 岳宁,丁铭,董家红,罗延青,张仲凯. 云南大学学报(自然科学版). 2008(S1)
[5]江苏省番茄黄化曲叶病毒病（TYLCD）的发生与诊断初报[J]. 赵统敏,余文贵,周益军,季英华. 江苏农业学报. 2007(06)
[6]Phylogenetic relationships of native and introduced Bemisia tabaci （Homoptera:Aleyrodidae） from China and India based on mtCOI DNA sequencing and host plant comparisons[J]. Susan A.Coats,Ali M.Idris,Judith K.Brown. Progress in Natural Science. 2007(06)
[7]温州地区番茄曲叶病毒病发生与防治[J]. 吴永汉,张纯胄,许方程,李芳芳,陈为康,卢启强,夏万青. 中国蔬菜. 2007(05)
[8]上海温室番茄黄化曲叶病毒病的发生与防治[J]. 王冬生,匡开源,张穗,戴富民,李琳一,瞿培荣,程银坤,王次马. 长江蔬菜. 2006(10)
[9]Sequence Analysis of mtDNA COI Gene and Molecular Phylogeny of Different Geographical Populations of Bemisia tabaci （Gennadius）[J]. CHU Dong1,2, ZHANG You-jun1, CONG Bin2, XU Bao-yun1, WU Qing-jun1 and ZHU Guo-ren11 Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, P.R.China2 College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, P.R.China. Agricultural Sciences in China. 2005(07)
[10]广东番茄曲叶病毒G3分离物基因组DNA-A的分子特征[J]. 何自福,虞皓,罗方芳. 植物病理学报. 2005(03)
本文编号：3396428
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：110 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
TYLCV基因组结构图（Gronenborn,2007）
能的重要途径，目前酵母双杂交、双分子荧光互补、pull-down、免疫共沉淀、噬菌都可用于蛋白质互作研究，其中，酵母双杂交是一种操作相对简单、成本低且十分该技术已经被广泛应用于基因的表达与调控、信号传导等领域的研究中。母双杂交原理双杂交系统最早是 Field 等人在 1989 年建立起来的，主要是用于明确蛋白之间相方法（Fields et al., 1989）。真核生物转录激活因子一般由两个结构上可以分割且功域组成，其中，酿酒酵母的转录因子包括转录激活域（Transcriptional activation dNA 结合域（DNA-binding domain, BD）（Uetz，2012），BD 可以识别并结合转录激操纵子结构，AD 通过与转录因子结合来启动下游基因，只有当 AD 和 BD 结合后用，启动下游基因转录，酵母双杂交技术就是利用这一特点开发而来的。当两个待于 AD 和 BD 结合，构成的两个融合载体分别称为猎物载体和诱饵载体，两个重组株中得到表达，只有两个待测蛋白可以发生互作时，AD 和 BD 才可以在空间位置合，进而激活下游靶标基因的转录和翻译表达。目前，通过基因工程工具，已经成改造为有直观表症的报告基因，这样，通过报告基因能否正常表达可以直接判定两否有互作关系。
业科学院博士学位论文 第一章 引组成的小分子蛋白质，常作为一种信号组分与其它蛋白质相连，可被一种专一化的蛋白quitin specific protease, UBP）所识别并将与其相连的蛋白质切割下来。根据泛素的结构特点功能不变的前提下，将其分为 C 端（C terminal part of ubiquitin, Cub）和 N 端（N termif ubiquitin, Nub）的两部分（Kittanakom et al., 2009）；然后把 Nub 的第 13 位氨基酸突变（NubG），这样 Cub 和 Nub 就不能正常结合成为泛素，而 Cub 仍可以与-LexA-VP16 进UBP 也就不能识别并水解与之结合的-LexA-VP16，下游报告基因的转录不能被激活，不到报告基因。将待检测的两个蛋白质分别于 C 端和 N 端连接并在酵母中融合表达，蛋白可以互作，则会使分离的 NubG 和 Cub 空间拉近而结合形成完整的泛素，于是与之LexA-VP16 蛋白就可以被 UBP 水解下来，进而激活下游报告基因。所以，通过检测下游就可以判定待检测两个蛋白是否发生了互作。
【参考文献】：
期刊论文
[1]我国棉花主产区棉蚜对吡虫啉的抗性监测及抗性机理[J]. 崔丽,张靖,齐浩亮,王芹芹,陆宴辉,芮昌辉. 昆虫学报. 2016(11)
[2]病毒蛋白质相互作用的研究方法及其应用[J]. 郭舒杨,周旭,国泰. 微生物学免疫学进展. 2011(01)
[3]灰飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建及分析[J]. 肖冬来,邓慧颖,谢荔岩,吴祖建,谢联辉. 植物保护. 2011(01)
[4]中国番茄黄化曲叶病毒在云南的发生分布及其遗传多样性[J]. 岳宁,丁铭,董家红,罗延青,张仲凯. 云南大学学报(自然科学版). 2008(S1)
[5]江苏省番茄黄化曲叶病毒病（TYLCD）的发生与诊断初报[J]. 赵统敏,余文贵,周益军,季英华. 江苏农业学报. 2007(06)
[6]Phylogenetic relationships of native and introduced Bemisia tabaci （Homoptera:Aleyrodidae） from China and India based on mtCOI DNA sequencing and host plant comparisons[J]. Susan A.Coats,Ali M.Idris,Judith K.Brown. Progress in Natural Science. 2007(06)
[7]温州地区番茄曲叶病毒病发生与防治[J]. 吴永汉,张纯胄,许方程,李芳芳,陈为康,卢启强,夏万青. 中国蔬菜. 2007(05)
[8]上海温室番茄黄化曲叶病毒病的发生与防治[J]. 王冬生,匡开源,张穗,戴富民,李琳一,瞿培荣,程银坤,王次马. 长江蔬菜. 2006(10)
[9]Sequence Analysis of mtDNA COI Gene and Molecular Phylogeny of Different Geographical Populations of Bemisia tabaci （Gennadius）[J]. CHU Dong1,2, ZHANG You-jun1, CONG Bin2, XU Bao-yun1, WU Qing-jun1 and ZHU Guo-ren11 Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, P.R.China2 College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, P.R.China. Agricultural Sciences in China. 2005(07)
[10]广东番茄曲叶病毒G3分离物基因组DNA-A的分子特征[J]. 何自福,虞皓,罗方芳. 植物病理学报. 2005(03)
本文编号：3396428
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