基于核荧光标记的果生刺盘孢有性交配系统分析
发布时间：2021-09-19 20:26
苹果炭疽叶枯病是我国近几年金冠系苹果上发生流行的一种毁灭性病害,对苹果产业造成巨大威胁。主要致病菌果生刺盘孢Colletotrichum fructicola易于产生子囊孢子。子囊孢子在该病害的田间流行及远距离传播中发挥重要作用。本研究室前期从单个子囊中获得两类不同有性生殖方式单孢菌株:类型一（1104-7-WS）可以以同宗配合方式进行完整有性生殖,产生发育良好子囊和子囊孢子;类型二（1104-6-B）以同宗配合方式进行不完整有性生殖,子囊壳发育良好,子囊及子囊孢子偶见、发育不良。本研究拟以两种不同表型的果生刺盘孢为供试菌株,基于基因敲入技术将荧光蛋白基因GFP、mCherry定点插入到组蛋白H1位点上,实现细胞核荧光标记,并结合黑色素合成相关基因敲除,获得白化突变体。通过对这些菌株的有性行为进行研究,取得以下主要结果:1.将标记GFP荧光基因的菌株1104-7-WSGfp与mCherry荧光基因的1104-6-BmCherry菌株对峙培养,发现在两个菌株接触处形成一条明显“交配线”,镜检观察到交配线的黑色颗粒物为子囊壳,内含子囊及子囊孢子,交配线上子囊壳形成时间明显早于类型一菌株,表...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
有性生殖过程
第一章 文献综述 7菌株杂交时，更有利于有性态的形成（张玮 2015）。这与以前报道的小丛壳属存在“ +”、“-”型菌株相似，其中 1104-7-WS 菌株相当于“+”型菌株，而 1104-6-B株相当于“-”型菌株。进一步对 1104-7-WS、1104-6-B两种菌株进行基因组测序，发现两种菌株均只有AT1-2-1 基因，而缺乏 MAT1-1-1 基因。而菌株 1104-7-WS 既能进行同宗配合又能进异宗配合，1104-6-B菌株可与 1104-7-WS 菌株杂交产生后代。所以将果生刺盘孢 C.ucticola 有性生殖归结成一种非典型同宗配合。至于该菌株如何在不具有 MAT1-1-1因的条件下完成有性繁殖，及控制其同宗配合与异宗配合行为的遗传因素目前尚未知。
在第一轮 PCR 扩增中，使用引物对 P1/P2，扩增出待融合片段 hisH1-U，片段大为 1.2 kb；使用 P3/P4 引物对，扩增出 hisH1-D片段，大小为 1 kb；使用 P5/P6 引物，扩增出 GFP-hp 片段，大小为 2.3 kb；使用 P7/P8 引物对，得到片段 pt，大小为.2 kb（图 3-1A, Lane 1-4），和预期大小一致（董秋月等 2018）。在第二轮融合 PCR 扩增中，使用引物对 P1Nest/P6Nest，获得上游敲入片段 hisH1--GFP-hp，大小为 3.1 kb；使用引物对 P7Nest/P4Nest，获得下游敲入片段 pt-hisH1-，大小为 2.2 kb（图 3-1A, Lane 5-6），和预期大小一样。使用 pEASYR-Blunt Zero Cloning Kit 克隆试剂盒，对融合片段 hisH1-U-GFP-hp 和t-hisH1-D 进行克隆，得到重组质粒 pEASYR-Blunt-Zero-hisH1-U-GFP-hp 和 pEASYR-lunt-Zero-pt-hisH1-D。对质粒 pEASYR-Blunt-Zero-hisH1-U-GFP-hp 进行双酶切验证，切位点是 EcoRI 和 HindIII；对质粒 pt-hisH1-D 进行双酶切验证，酶切位点是 EcoRI XbaI（图 3-1B），送到北京奥科生物技术有限公司测序验证，成功构建 GFP 表达体，且基因序列正确无误。对于含有 mCherry的表达载体进行敲入，其上游融合片段 hisH1-U-mCherry-hp 的建方法同 GFP，下游的融合片段 pt-hisH1-D 同 GFP的下游一样。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于报告基因敲入构建果生刺盘孢细胞核荧光标记菌株[J]. 董秋月,梁晓飞,张玮,孙广宇,张荣. 菌物学报. 2018(02)
[2]PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola原生质体转化[J]. 韩小路,白静科,张玮,张荣,孙广宇. 西北农业学报. 2016(03)
[3]围小丛壳Glomerella cingulata子囊孢子交配繁殖、生物学特性及致病性[J]. 张路,王彩霞,李保华,李宝笃. 菌物学报. 2015(06)
[4]苹果炭疽叶枯病危害特点与防治措施[J]. 宋世志,李湘南,刘美英,赵玲玲,姜中武. 烟台果树. 2015(04)
[5]苹果炭疽叶枯病病原学研究[J]. 王薇,符丹丹,张荣,孙广宇. 菌物学报. 2015(01)
[6]陕西咸阳苹果炭疽叶枯病的发生与防控[J]. 孙芳娟,查养良,李保华,高登涛,胡晓望. 中国果树. 2015(01)
[7]苹果炭疽叶枯病发生规律与防治办法[J]. 王志龙,郭鹏亮. 西北园艺(果树). 2014(05)
[8]炭疽菌叶枯病在我国苹果产区的发生分布及趋势分析[J]. 党建美,胡清玉,张瑜,王树桐,曹克强. 北方园艺. 2014(10)
[9]苹果炭疽菌叶枯病防控研究[J]. 曹依静,党伟,孙共明,刘利民. 北方园艺. 2014(09)
[10]苹果炭疽叶枯病的发生与防治[J]. 王晓娥. 农业科技通讯. 2014(03)
博士论文
[1]中国贵州、云南、广西炭疽菌属真菌多基因分子系统学研究[D]. 杨友联.华中农业大学 2010
硕士论文
[1]果生炭疽菌Colletotrichum fructicola有性生殖遗传特性研究[D]. 张玮.西北农林科技大学 2016
[2]云南省部分观赏植物叶面病原真菌的多样性调查和系统学研究[D]. 张艳敏.中国林业科学研究院 2012
本文编号：3402280
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
有性生殖过程
第一章 文献综述 7菌株杂交时，更有利于有性态的形成（张玮 2015）。这与以前报道的小丛壳属存在“ +”、“-”型菌株相似，其中 1104-7-WS 菌株相当于“+”型菌株，而 1104-6-B株相当于“-”型菌株。进一步对 1104-7-WS、1104-6-B两种菌株进行基因组测序，发现两种菌株均只有AT1-2-1 基因，而缺乏 MAT1-1-1 基因。而菌株 1104-7-WS 既能进行同宗配合又能进异宗配合，1104-6-B菌株可与 1104-7-WS 菌株杂交产生后代。所以将果生刺盘孢 C.ucticola 有性生殖归结成一种非典型同宗配合。至于该菌株如何在不具有 MAT1-1-1因的条件下完成有性繁殖，及控制其同宗配合与异宗配合行为的遗传因素目前尚未知。
在第一轮 PCR 扩增中，使用引物对 P1/P2，扩增出待融合片段 hisH1-U，片段大为 1.2 kb；使用 P3/P4 引物对，扩增出 hisH1-D片段，大小为 1 kb；使用 P5/P6 引物，扩增出 GFP-hp 片段，大小为 2.3 kb；使用 P7/P8 引物对，得到片段 pt，大小为.2 kb（图 3-1A, Lane 1-4），和预期大小一致（董秋月等 2018）。在第二轮融合 PCR 扩增中，使用引物对 P1Nest/P6Nest，获得上游敲入片段 hisH1--GFP-hp，大小为 3.1 kb；使用引物对 P7Nest/P4Nest，获得下游敲入片段 pt-hisH1-，大小为 2.2 kb（图 3-1A, Lane 5-6），和预期大小一样。使用 pEASYR-Blunt Zero Cloning Kit 克隆试剂盒，对融合片段 hisH1-U-GFP-hp 和t-hisH1-D 进行克隆，得到重组质粒 pEASYR-Blunt-Zero-hisH1-U-GFP-hp 和 pEASYR-lunt-Zero-pt-hisH1-D。对质粒 pEASYR-Blunt-Zero-hisH1-U-GFP-hp 进行双酶切验证，切位点是 EcoRI 和 HindIII；对质粒 pt-hisH1-D 进行双酶切验证，酶切位点是 EcoRI XbaI（图 3-1B），送到北京奥科生物技术有限公司测序验证，成功构建 GFP 表达体，且基因序列正确无误。对于含有 mCherry的表达载体进行敲入，其上游融合片段 hisH1-U-mCherry-hp 的建方法同 GFP，下游的融合片段 pt-hisH1-D 同 GFP的下游一样。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于报告基因敲入构建果生刺盘孢细胞核荧光标记菌株[J]. 董秋月,梁晓飞,张玮,孙广宇,张荣. 菌物学报. 2018(02)
[2]PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola原生质体转化[J]. 韩小路,白静科,张玮,张荣,孙广宇. 西北农业学报. 2016(03)
[3]围小丛壳Glomerella cingulata子囊孢子交配繁殖、生物学特性及致病性[J]. 张路,王彩霞,李保华,李宝笃. 菌物学报. 2015(06)
[4]苹果炭疽叶枯病危害特点与防治措施[J]. 宋世志,李湘南,刘美英,赵玲玲,姜中武. 烟台果树. 2015(04)
[5]苹果炭疽叶枯病病原学研究[J]. 王薇,符丹丹,张荣,孙广宇. 菌物学报. 2015(01)
[6]陕西咸阳苹果炭疽叶枯病的发生与防控[J]. 孙芳娟,查养良,李保华,高登涛,胡晓望. 中国果树. 2015(01)
[7]苹果炭疽叶枯病发生规律与防治办法[J]. 王志龙,郭鹏亮. 西北园艺(果树). 2014(05)
[8]炭疽菌叶枯病在我国苹果产区的发生分布及趋势分析[J]. 党建美,胡清玉,张瑜,王树桐,曹克强. 北方园艺. 2014(10)
[9]苹果炭疽菌叶枯病防控研究[J]. 曹依静,党伟,孙共明,刘利民. 北方园艺. 2014(09)
[10]苹果炭疽叶枯病的发生与防治[J]. 王晓娥. 农业科技通讯. 2014(03)
博士论文
[1]中国贵州、云南、广西炭疽菌属真菌多基因分子系统学研究[D]. 杨友联.华中农业大学 2010
硕士论文
[1]果生炭疽菌Colletotrichum fructicola有性生殖遗传特性研究[D]. 张玮.西北农林科技大学 2016
[2]云南省部分观赏植物叶面病原真菌的多样性调查和系统学研究[D]. 张艳敏.中国林业科学研究院 2012
本文编号：3402280
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/dzwbhlw/3402280.html
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