华北大黑鳃金龟OBPs异源二聚体对气味分子的识别机制
发布时间：2021-10-11 15:35
华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita Faldermann）隶属鞘翅目,鳃金龟科,其幼虫蛴螬,是花生、大豆、小麦、玉米、马铃薯等作物的重要地下害虫,危害严重,防治困难。采用“地下害虫,地上防治”、“防治成虫,控制幼虫”的策略,寻找一种高效、无污染的华北大黑鳃金龟成虫防治新途径已成为当务之急,其中利用寄主植物的挥发物诱杀成虫是目前华北大黑鳃金龟防治的一种潜在绿色防控技术。本文以阐明其成虫触角中两种气味结合蛋白（HoblOBP1和HoblOBP2）的互作能增强对气味化合物的结合能力为目标;通过荧光原位杂交技术证明了HoblOBP1和HoblOBP2在成虫触角中的共表达;利用蛋白分子对接技术对两蛋白的结合模式及其两蛋白复合物与气味分子的关键结合位点进行预测与分析;采用定点突变技术,获得特定的突变基因,进而表达纯化以获得不同的突变蛋白;通过荧光结合实验明确不同结合位点在HoblOBP1/OBP2复合物识别活性气味分子中的影响,从而解析OBPs异源二聚体的形成机制及其对气味分子的识别机制。主要研究结果如下:1.荧光原位杂交实验表明HoblOBP1和HoblOBP2在华北大黑鳃金龟...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
华北大黑鳃金龟的生命周期Figure1-1LifecycleofHolotrichiaoblita
（15）再接着用 200mL 灭菌水洗 3min，常温下在摇床上进行。（16）配制显色剂：在室温下，按顺序依次将 10mL AP-Buffer，66uL NBT，33uL BCIP 加入50mL 离心管中，在黑暗中搅拌至均匀。在每张载玻片上加入 1mL 的显色剂并盖上盖玻片，放在蓝色板上，在摇床上染色 1h（摇床上，转速从 0 开始，慢慢进行，注意避光）。（17）染色后，用 1×TBST 在玻璃皿中洗 3 次，最后取出组织玻片，用卫生纸吸干玻片，向组织切片上加入 100uL PBS/甘油（PBS:甘油=1:2），盖上盖玻片，正面向上放在蓝板上，短期内置于 4℃冰箱中保存。（18）第二天，从 4℃中取出已洗好的组织切片，用荧光显微镜和共聚焦显微镜观测华北大黑鳃金龟 HoblOBP1 和 HoblOBP2 在触角组织中表达的荧光信号。2.2 结果与分析荧光原位杂交技术检测利用不同荧光素标记探针的 HoblOBP1 和 HoblOBP2 在华北大黑鳃金龟成虫触角感器中的共表达（图 2-1）。其中荧光素 FTIC 和 Cy3 分别标记探针 HoblOBP1 和HoblOBP2，在荧光显微镜下 HoblOBP1 和 HoblOBP2 探针标记的细胞分别呈现绿色荧光信号和红色荧光信号（图 2-1 B、E 和 C、F）。荧光杂交后，荧光素标记的基因在细胞中是可见，从图 2-1D、G、H 中可以看到 HoblOBP1 和 HoblOBP2 在触角感器细胞中共表达。
图 3-1 华北大黑鳃金龟 OBP1、OBP2 和 OBP1/OBP2 配体结合口袋的预测Figure 3-1 Prediction ligand binding pocket of the OBP1, OBP2, OBP1/OBP2 in H. oblita3.2.1.2 HoblOBP1、HoblOBP2 和 HoblOBP1/OBP2 蛋白复合物的配体结合口袋的比较从图 3-1 中可以较清晰的看出 HoblOBP1、HoblOBP2 和 HoblOBP1/OBP2 配体结合口袋的置。从组成配体结合口袋的残基数量来看，HoblOBP1 口袋最小，而 HoblOBP1/OBP2 的配体袋是最大的。其中 HoblOBP1/OBP2 复合物的口袋主要是由 HoblOBP2 提供的，但由于复合物袋还有一部分是由 HoblOBP1 提供的，两蛋白之间的间隙也作为口袋一部分，使得复合物蛋白合口袋较HoblOBP2大一些。本实验借助于分子模拟软件Sybyl7.3中的分子对接模块Surflex-Do（Jain, 2003）对蛋白与化合物的结合能力进行预测，其获得分数越高，表明结合能力越强Surflex-Dock 打分函数的结果显示，四种配体与两蛋白复合物的对接分数均高于与 HoblOBP1HoblOBP2 对接的分数（表 3-1），从而说明蛋白复合物与四种配体的结合活性高于单一蛋白的合活性，这与先前实验结果一致（王冰，2013）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]暗黑鳃金龟气味结合蛋白HparOBP15a基因的克隆及功能分析[J]. 房迟琴,张鑫鑫,刘丹丹,李克斌,张帅,曹雅忠,樊东,尹姣. 昆虫学报. 2016(03)
[2]基于谱聚类的蛋白质对接复合物最佳预测结构的挑选方法[J]. 蔡磊鑫,陈荣,吕强. 小型微型计算机系统. 2015(10)
[3]我国化学防治甘蔗金龟子研究进展[J]. 商显坤,黄诚华,王伯辉. 南方农业学报. 2011(10)
[4]大田蛴螬的防治技术[J]. 张世忠. 农业与技术. 2011(02)
[5]球孢白僵菌防治花生田蛴螬药效试验研究[J]. 陈正州,薛兆银,周靖,徐家忠. 现代农业科技. 2011(04)
[6]绿僵菌与几种药剂防治花生蛴螬的比较试验[J]. 李霞荣,张兴桃,陈军,刘领,刘小阳. 宿州学院学报. 2011(02)
[7]绿僵菌CQMa128乳粉剂对蛴螬时间-剂量-死亡率模型分析[J]. 谢宁,王中康,张建伟,陈环,殷幼平. 中国生物防治. 2010(04)
[8]植物挥发性信息化学物质在昆虫寄主选择行为中的作用[J]. 戴建青,韩诗畴,杜家纬. 环境昆虫学报. 2010(03)
[9]河北异小杆线虫一品系的分类鉴定及其对蛴螬致病力的测定[J]. 刘树森,李克斌,刘春琴,王庆雷,尹姣,曹雅忠. 昆虫学报. 2009(09)
[10]河南部分地区花生田地下害虫发生情况调查[J]. 罗宗秀,李克斌,曹雅忠,尹姣,张杰,张静涛,尚光强. 植物保护. 2009(02)
博士论文
[1]华北大黑鳃金龟嗅觉相关蛋白互作机制研究[D]. 王冰.中国农业科学院 2013
硕士论文
[1]铜绿丽金龟气味结合蛋白功能分析[D]. 赵莹.西北农林科技大学 2014
[2]华北大黑鳃金龟气味结合蛋白特异结合位点探讨[D]. 庄绪静.中国农业科学院 2012
[3]华北大黑鳃金龟气味结合蛋白功能分析[D]. 邓思思.中国农业科学院 2011
[4]金龟甲调查及其优势种性信息素鉴定与应用研究[D]. 罗宗秀.中国农业科学院 2010
本文编号：3430792
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
华北大黑鳃金龟的生命周期Figure1-1LifecycleofHolotrichiaoblita
（15）再接着用 200mL 灭菌水洗 3min，常温下在摇床上进行。（16）配制显色剂：在室温下，按顺序依次将 10mL AP-Buffer，66uL NBT，33uL BCIP 加入50mL 离心管中，在黑暗中搅拌至均匀。在每张载玻片上加入 1mL 的显色剂并盖上盖玻片，放在蓝色板上，在摇床上染色 1h（摇床上，转速从 0 开始，慢慢进行，注意避光）。（17）染色后，用 1×TBST 在玻璃皿中洗 3 次，最后取出组织玻片，用卫生纸吸干玻片，向组织切片上加入 100uL PBS/甘油（PBS:甘油=1:2），盖上盖玻片，正面向上放在蓝板上，短期内置于 4℃冰箱中保存。（18）第二天，从 4℃中取出已洗好的组织切片，用荧光显微镜和共聚焦显微镜观测华北大黑鳃金龟 HoblOBP1 和 HoblOBP2 在触角组织中表达的荧光信号。2.2 结果与分析荧光原位杂交技术检测利用不同荧光素标记探针的 HoblOBP1 和 HoblOBP2 在华北大黑鳃金龟成虫触角感器中的共表达（图 2-1）。其中荧光素 FTIC 和 Cy3 分别标记探针 HoblOBP1 和HoblOBP2，在荧光显微镜下 HoblOBP1 和 HoblOBP2 探针标记的细胞分别呈现绿色荧光信号和红色荧光信号（图 2-1 B、E 和 C、F）。荧光杂交后，荧光素标记的基因在细胞中是可见，从图 2-1D、G、H 中可以看到 HoblOBP1 和 HoblOBP2 在触角感器细胞中共表达。
图 3-1 华北大黑鳃金龟 OBP1、OBP2 和 OBP1/OBP2 配体结合口袋的预测Figure 3-1 Prediction ligand binding pocket of the OBP1, OBP2, OBP1/OBP2 in H. oblita3.2.1.2 HoblOBP1、HoblOBP2 和 HoblOBP1/OBP2 蛋白复合物的配体结合口袋的比较从图 3-1 中可以较清晰的看出 HoblOBP1、HoblOBP2 和 HoblOBP1/OBP2 配体结合口袋的置。从组成配体结合口袋的残基数量来看，HoblOBP1 口袋最小，而 HoblOBP1/OBP2 的配体袋是最大的。其中 HoblOBP1/OBP2 复合物的口袋主要是由 HoblOBP2 提供的，但由于复合物袋还有一部分是由 HoblOBP1 提供的，两蛋白之间的间隙也作为口袋一部分，使得复合物蛋白合口袋较HoblOBP2大一些。本实验借助于分子模拟软件Sybyl7.3中的分子对接模块Surflex-Do（Jain, 2003）对蛋白与化合物的结合能力进行预测，其获得分数越高，表明结合能力越强Surflex-Dock 打分函数的结果显示，四种配体与两蛋白复合物的对接分数均高于与 HoblOBP1HoblOBP2 对接的分数（表 3-1），从而说明蛋白复合物与四种配体的结合活性高于单一蛋白的合活性，这与先前实验结果一致（王冰，2013）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]暗黑鳃金龟气味结合蛋白HparOBP15a基因的克隆及功能分析[J]. 房迟琴,张鑫鑫,刘丹丹,李克斌,张帅,曹雅忠,樊东,尹姣. 昆虫学报. 2016(03)
[2]基于谱聚类的蛋白质对接复合物最佳预测结构的挑选方法[J]. 蔡磊鑫,陈荣,吕强. 小型微型计算机系统. 2015(10)
[3]我国化学防治甘蔗金龟子研究进展[J]. 商显坤,黄诚华,王伯辉. 南方农业学报. 2011(10)
[4]大田蛴螬的防治技术[J]. 张世忠. 农业与技术. 2011(02)
[5]球孢白僵菌防治花生田蛴螬药效试验研究[J]. 陈正州,薛兆银,周靖,徐家忠. 现代农业科技. 2011(04)
[6]绿僵菌与几种药剂防治花生蛴螬的比较试验[J]. 李霞荣,张兴桃,陈军,刘领,刘小阳. 宿州学院学报. 2011(02)
[7]绿僵菌CQMa128乳粉剂对蛴螬时间-剂量-死亡率模型分析[J]. 谢宁,王中康,张建伟,陈环,殷幼平. 中国生物防治. 2010(04)
[8]植物挥发性信息化学物质在昆虫寄主选择行为中的作用[J]. 戴建青,韩诗畴,杜家纬. 环境昆虫学报. 2010(03)
[9]河北异小杆线虫一品系的分类鉴定及其对蛴螬致病力的测定[J]. 刘树森,李克斌,刘春琴,王庆雷,尹姣,曹雅忠. 昆虫学报. 2009(09)
[10]河南部分地区花生田地下害虫发生情况调查[J]. 罗宗秀,李克斌,曹雅忠,尹姣,张杰,张静涛,尚光强. 植物保护. 2009(02)
博士论文
[1]华北大黑鳃金龟嗅觉相关蛋白互作机制研究[D]. 王冰.中国农业科学院 2013
硕士论文
[1]铜绿丽金龟气味结合蛋白功能分析[D]. 赵莹.西北农林科技大学 2014
[2]华北大黑鳃金龟气味结合蛋白特异结合位点探讨[D]. 庄绪静.中国农业科学院 2012
[3]华北大黑鳃金龟气味结合蛋白功能分析[D]. 邓思思.中国农业科学院 2011
[4]金龟甲调查及其优势种性信息素鉴定与应用研究[D]. 罗宗秀.中国农业科学院 2010
本文编号：3430792
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/dzwbhlw/3430792.html
最近更新
教材专著
