苹果黑腐皮壳菌G蛋白-cAMP-PKA信号通路相关基因的功能研究
发布时间：2021-10-13 08:54
由苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）引起的苹果树腐烂病,是苹果上的一种毁灭性真菌病害。一旦病菌侵入到苹果树枝干的韧皮部和木质部,生产上只能利用外科手术及化学药剂进行防治,但是化学药剂由于很难达到树皮和树干深层,无法很好的控制病害,从而导致生产上严重的产量和经济损失。因此,解析苹果黑腐皮壳菌的致病机制对于开发新的腐烂病防治策略具有重要意义。病原菌通过G蛋白所调控的cAMP/PKA（the cyclic AMP/protein kinase A）信号转导途径对外界的变化做出改变,从而调控病原真菌的致病性。G蛋白,G蛋白调控因子（RGS）,以及PKA是G蛋白-cAMP-PKA信号通路的三个重要组成部分。本论文借助苹果黑腐皮壳菌全基因组测序信息,对苹果黑腐皮壳菌G蛋白α亚基、RGS和蛋白激酶A的两个催化亚基开展研究,明确它们在苹果黑腐皮壳菌生长发育以及侵染致病等过程中的作用。该研究为全面揭示苹果黑腐皮壳菌的致病机理奠定基础,进而为制定苹果树腐烂病防治新策略,提供重要的理论依据。主要研究结果如下:1.苹果黑腐皮壳菌G蛋白α亚基Gvm2和Gvm3基因的鉴定和功能分析G蛋白可以通过调控cAMP/...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：98 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
异三聚体蛋白信号途径模式（Lietal.2007）
图2-1基于同源重组的基因敲除和四对引物PCR检测转化子示意图Fig.2-1GeneknockoutbyhomologousrecombinationandPCRscreeningoftransformantswithfourpairprimers.2.3.2.2Double-jointPCR方法构建敲除载体为了检验Gα蛋白的生物学功能，我们拟生成三个基因Gvm1，Gvm2和Gvm3的敲除突变体。我们使用Double-jointPCR的方法构建基因敲除盒（Yuetal.2014）。根据苹果黑腐皮壳菌基因组数据库中基因两侧的基因组DNA序列，分别选取开放阅读框上游与下游各1kb左右的DNA序列作为同源重组时的上臂和下臂，构建基因敲除体系。以03-8基因组DNA为模板分别用引物对Gvm1-1F/Gvm1-2R，Gvm1-3F/Gvm1-4R，Gvm2-1F/Gvm2-2R，Gvm2-3F/Gvm2-4R和Gvm3-1F/Gvm3-2R，Gvm3-3F/Gvm3-4R扩出上游片段L1和下游片段L2，以携带潮霉素磷酸转移酶基因（hph）的质粒PHIG2RHPH2-GFP-GUS为模板用引物HYG-F/HYG-R扩增hph基因片段，并胶回收PCR产物。接着用Double-jointPCR方法将3段片段连接在一起，构建敲除片段。构建好的敲除片段转化进入野生型菌株03-8通过同源重组实现基因敲除。2.3.2.3野生型苹果黑腐皮壳菌原生质体的制备和转化（1）将03-8野生型菌株接种到铺玻璃纸的PDA平板上，25℃培养2d。将菌丝刮成小块接种到含有100mlYEPD液体培养基的250ml三角瓶中，25℃，110rpm培养36h。（2）用无菌滤布过滤收集菌丝，称量菌丝并加入酶解液（0.7g菌丝/10ml酶解液）。（3）放置于摇床上30℃，90rpm摇约2-2.5h。（4）显微镜下观察，酶解完成后，上面放两层擦镜纸下面放一层无菌滤布过滤酶解混合物到无菌的50ml离心管中，再用1.2M的KCl冲洗，以便将原生质体尽可能多的洗下来，用KCl定容至50ml。（5）室温4500rpm离心10min。（6）弃上清，加入15mlSTCBuffer用移液枪轻微的重新悬浮，4
图2-2接种位置示意图Fig.2-2Inoculatelocationdiagram.2.3.8胞内cAMP浓度和PKA活性分析收集YEPD摇培3d的菌丝体，液氮冷冻。样品的cAMP浓度由苏州科铭生物技术有限公司采用HPLC方法测定。数据分析采用SAS软件包（SASInstitute,Cary,USA）平均数差异显著性t检验分析，p<0.05。收集YEPD摇培3d的菌丝体用于PKA活性检测，液氮研磨0.3g的菌丝样品。PKA活性检测使用PepTag非放射性蛋白激酶检测系统(Promega,Madison,USA)测定。测定样品用1.2%的琼脂糖凝胶160V电压跑15min。紫外透照器检测。2.4试验结果2.4.1G蛋白α亚基序列分析与比较根据M.oryzaeMagA,MagB和MagCGα亚基蛋白序列分别在苹果黑腐皮壳菌转录组和基因组数据库中Blast比对分析，共找到3个异源三聚体G蛋白的Gα亚基，命名为Gvm1(VM1G_00876),Gvm2(VM1G_09956)和Gvm3(VM1G_04248)。Gvm1基因编码含353个氨基酸的多肽包括3个内含子，与稻瘟病菌的MAGB(AF011341)有98.6%的相似性，与粗糙脉孢菌的GNA-1(XP957133)有98.3%的相似性，与酿酒酵母Gpa1(NP011868)有28.5%的相似性。Gvm2基因编码含357个氨基酸的多肽包括4个内含子，与稻瘟病菌的MAGC(AF011342)有82.7%的相似性，与粗糙脉孢菌的GNA-2(Q05424)有81.0%的相似性。Gvm3基因编码含355个氨基酸的多肽包括5个内含子，与稻瘟病菌的MAGA(AF011340)有89.9%的相似性，与粗糙脉孢菌的GNA-3(XP962205)有85.4%的相似性，与酿酒酵母Gpa2(NP010937)有40.1%的相似性（图2-3A）。不同的异源三聚体G蛋白α亚基的系统发育树分为三个组群：组群I，组群II和组21
【参考文献】：
期刊论文
[1]苹果树腐烂病菌果胶裂解酶基因Vmpl4的致病功能研究[J]. 许春景,孙迎超,吴玉星,冯浩,高小宁,黄丽丽. 果树学报. 2017(01)
[2]苹果树腐烂病菌多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8的功能[J]. 许春景,吴玉星,戴青青,李正鹏,高小宁,黄丽丽. 中国农业科学. 2016(08)
[3]陕西渭北地区苹果树腐烂病发生情况调查[J]. 李正鹏,高小宁,杜战涛,胡杨,康振生,黄丽丽. 西北农业学报. 2013(01)
[4]苹果树腐烂病室内快速评价方法的研究[J]. 韦洁玲,黄丽丽,郜佐鹏,柯希望,康振生. 植物病理学报. 2010(01)
[5]七株植物内生放线菌对苹果树腐烂病的防治作用[J]. 郜佐鹏,柯希望,韦洁玲,陈银潮,康振生,黄丽丽. 植物保护学报. 2009(05)
[6]中国苹果树腐烂病发生和防治情况调查[J]. 曹克强,国立耘,李保华,孙广宇,陈汉杰. 植物保护. 2009(02)
[7]陕西渭北地区盛果期苹果树腐烂病调查研究[J]. 马志峰,王荣花,刘文国,康克功,高平文. 北方园艺. 2007(10)
[8]苹果树腐烂病菌分生孢子萌发及其影响条件研究[J]. 臧睿,黄丽丽. 西北农业学报. 2007(01)
[9]陕北地区苹果树腐烂病防治建议[J]. 王金友. 西北园艺(果树). 2006(02)
[10]陕西省关中地区苹果树腐烂病调查初报[J]. 王磊,臧睿,黄丽丽,谢芳琴,高小宁. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2005(S1)
博士论文
[1]中国苹果树腐烂病菌的种类：rDNA-ITS序列和表型比较研究[D]. 王旭丽.西北农林科技大学 2007
硕士论文
[1]苹果树腐烂病菌三个果胶酶基因的致病功能研究[D]. 许春景.西北农林科技大学 2016
[2]苹果树腐烂病菌4个多聚半乳糖醛酸酶基因功能的初步研究[D]. 宋娜.西北农林科技大学 2014
[3]苹果树腐烂病菌致病物质的初步研究[D]. 王建华.西北农林科技大学 2012
[4]陕西苹果树腐烂病菌不同分离株生物学特性及致病性研究[D]. 臧睿.西北农林科技大学 2006
本文编号：3434343
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：98 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
异三聚体蛋白信号途径模式（Lietal.2007）
图2-1基于同源重组的基因敲除和四对引物PCR检测转化子示意图Fig.2-1GeneknockoutbyhomologousrecombinationandPCRscreeningoftransformantswithfourpairprimers.2.3.2.2Double-jointPCR方法构建敲除载体为了检验Gα蛋白的生物学功能，我们拟生成三个基因Gvm1，Gvm2和Gvm3的敲除突变体。我们使用Double-jointPCR的方法构建基因敲除盒（Yuetal.2014）。根据苹果黑腐皮壳菌基因组数据库中基因两侧的基因组DNA序列，分别选取开放阅读框上游与下游各1kb左右的DNA序列作为同源重组时的上臂和下臂，构建基因敲除体系。以03-8基因组DNA为模板分别用引物对Gvm1-1F/Gvm1-2R，Gvm1-3F/Gvm1-4R，Gvm2-1F/Gvm2-2R，Gvm2-3F/Gvm2-4R和Gvm3-1F/Gvm3-2R，Gvm3-3F/Gvm3-4R扩出上游片段L1和下游片段L2，以携带潮霉素磷酸转移酶基因（hph）的质粒PHIG2RHPH2-GFP-GUS为模板用引物HYG-F/HYG-R扩增hph基因片段，并胶回收PCR产物。接着用Double-jointPCR方法将3段片段连接在一起，构建敲除片段。构建好的敲除片段转化进入野生型菌株03-8通过同源重组实现基因敲除。2.3.2.3野生型苹果黑腐皮壳菌原生质体的制备和转化（1）将03-8野生型菌株接种到铺玻璃纸的PDA平板上，25℃培养2d。将菌丝刮成小块接种到含有100mlYEPD液体培养基的250ml三角瓶中，25℃，110rpm培养36h。（2）用无菌滤布过滤收集菌丝，称量菌丝并加入酶解液（0.7g菌丝/10ml酶解液）。（3）放置于摇床上30℃，90rpm摇约2-2.5h。（4）显微镜下观察，酶解完成后，上面放两层擦镜纸下面放一层无菌滤布过滤酶解混合物到无菌的50ml离心管中，再用1.2M的KCl冲洗，以便将原生质体尽可能多的洗下来，用KCl定容至50ml。（5）室温4500rpm离心10min。（6）弃上清，加入15mlSTCBuffer用移液枪轻微的重新悬浮，4
图2-2接种位置示意图Fig.2-2Inoculatelocationdiagram.2.3.8胞内cAMP浓度和PKA活性分析收集YEPD摇培3d的菌丝体，液氮冷冻。样品的cAMP浓度由苏州科铭生物技术有限公司采用HPLC方法测定。数据分析采用SAS软件包（SASInstitute,Cary,USA）平均数差异显著性t检验分析，p<0.05。收集YEPD摇培3d的菌丝体用于PKA活性检测，液氮研磨0.3g的菌丝样品。PKA活性检测使用PepTag非放射性蛋白激酶检测系统(Promega,Madison,USA)测定。测定样品用1.2%的琼脂糖凝胶160V电压跑15min。紫外透照器检测。2.4试验结果2.4.1G蛋白α亚基序列分析与比较根据M.oryzaeMagA,MagB和MagCGα亚基蛋白序列分别在苹果黑腐皮壳菌转录组和基因组数据库中Blast比对分析，共找到3个异源三聚体G蛋白的Gα亚基，命名为Gvm1(VM1G_00876),Gvm2(VM1G_09956)和Gvm3(VM1G_04248)。Gvm1基因编码含353个氨基酸的多肽包括3个内含子，与稻瘟病菌的MAGB(AF011341)有98.6%的相似性，与粗糙脉孢菌的GNA-1(XP957133)有98.3%的相似性，与酿酒酵母Gpa1(NP011868)有28.5%的相似性。Gvm2基因编码含357个氨基酸的多肽包括4个内含子，与稻瘟病菌的MAGC(AF011342)有82.7%的相似性，与粗糙脉孢菌的GNA-2(Q05424)有81.0%的相似性。Gvm3基因编码含355个氨基酸的多肽包括5个内含子，与稻瘟病菌的MAGA(AF011340)有89.9%的相似性，与粗糙脉孢菌的GNA-3(XP962205)有85.4%的相似性，与酿酒酵母Gpa2(NP010937)有40.1%的相似性（图2-3A）。不同的异源三聚体G蛋白α亚基的系统发育树分为三个组群：组群I，组群II和组21
【参考文献】：
期刊论文
[1]苹果树腐烂病菌果胶裂解酶基因Vmpl4的致病功能研究[J]. 许春景,孙迎超,吴玉星,冯浩,高小宁,黄丽丽. 果树学报. 2017(01)
[2]苹果树腐烂病菌多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8的功能[J]. 许春景,吴玉星,戴青青,李正鹏,高小宁,黄丽丽. 中国农业科学. 2016(08)
[3]陕西渭北地区苹果树腐烂病发生情况调查[J]. 李正鹏,高小宁,杜战涛,胡杨,康振生,黄丽丽. 西北农业学报. 2013(01)
[4]苹果树腐烂病室内快速评价方法的研究[J]. 韦洁玲,黄丽丽,郜佐鹏,柯希望,康振生. 植物病理学报. 2010(01)
[5]七株植物内生放线菌对苹果树腐烂病的防治作用[J]. 郜佐鹏,柯希望,韦洁玲,陈银潮,康振生,黄丽丽. 植物保护学报. 2009(05)
[6]中国苹果树腐烂病发生和防治情况调查[J]. 曹克强,国立耘,李保华,孙广宇,陈汉杰. 植物保护. 2009(02)
[7]陕西渭北地区盛果期苹果树腐烂病调查研究[J]. 马志峰,王荣花,刘文国,康克功,高平文. 北方园艺. 2007(10)
[8]苹果树腐烂病菌分生孢子萌发及其影响条件研究[J]. 臧睿,黄丽丽. 西北农业学报. 2007(01)
[9]陕北地区苹果树腐烂病防治建议[J]. 王金友. 西北园艺(果树). 2006(02)
[10]陕西省关中地区苹果树腐烂病调查初报[J]. 王磊,臧睿,黄丽丽,谢芳琴,高小宁. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2005(S1)
博士论文
[1]中国苹果树腐烂病菌的种类：rDNA-ITS序列和表型比较研究[D]. 王旭丽.西北农林科技大学 2007
硕士论文
[1]苹果树腐烂病菌三个果胶酶基因的致病功能研究[D]. 许春景.西北农林科技大学 2016
[2]苹果树腐烂病菌4个多聚半乳糖醛酸酶基因功能的初步研究[D]. 宋娜.西北农林科技大学 2014
[3]苹果树腐烂病菌致病物质的初步研究[D]. 王建华.西北农林科技大学 2012
[4]陕西苹果树腐烂病菌不同分离株生物学特性及致病性研究[D]. 臧睿.西北农林科技大学 2006
本文编号：3434343
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/dzwbhlw/3434343.html
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