水稻抗褐飞虱基因BPH9效应子的初步筛选

发布时间：2021-10-21 09:29

　　褐飞虱（Nilaparvata lugens Stal）是一种吸食水稻汁液的害虫,常对水稻产量造成毁灭性打击。传统农业中,通过大量使用杀虫剂来防治褐飞虱,但这仅是治标不治本,更易造成严重的环境污染。发掘抗性基因、培育抗性水稻品种是公认最为经济有效、环境友好的褐飞虱防治手段。至今为止,已经在稻种资源中发掘鉴定了 30多个抗褐飞虱基因,但现有研究中对其抗虫机理的了解甚少。本文在前人克隆水稻抗褐飞虱基因BPH9的基础上,进一步对其抗性机制进行了探索,所得结果如下:1、通过收集褐飞虱唾液蛋白,利用质谱测序方法对其进行鉴定,构建了水稻褐飞虱唾液蛋白质组数据库。本研究共鉴定到161个蛋白,蛋白注释结果表明酶类蛋白在鉴定出的唾液蛋白中所占比例最高。GO分析表明褐飞虱唾液蛋白主要参与生物反应过程、分子功能的发挥与细胞组分的形成。2、为筛选BPH9基因所识别的效应子,本论文共获得了 120个褐飞虱唾液蛋白基因的全长cDNA克隆,分析了其是否具有信号肽及可能的信号肽切割位点,分别构建了以pEarleyGate100为骨架的载体。通过将这些候选效应子与BPH9共转烟草进行瞬时表达未能得到能特异性激活BPH9... 

【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：88 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 水稻的重要性
    1.2 水稻褐飞虱研究概况
        1.2.1 水稻褐飞虱的生物学特征和抗性机理
            1.2.1.1 水稻褐飞虱的生物学特征
            1.2.1.2 水稻对褐飞虱的抗性机理
        1.2.2 褐飞虱对水稻的危害
        1.2.3 水稻抗褐飞虱基因的定位与克隆
    1.3 植物抗虫防御机制
        1.3.1 组成型防御机制
            1.3.1.1 物理性防御
            1.3.1.2 化学性防御
        1.3.2 诱导型防御机制
            1.3.2.1 HTI
            1.3.2.2 ETI
    1.4 效应子的研究概况
        1.4.1 效应子的一般特征
        1.4.2 昆虫效应子研究现状与发展
    1.5 蛋白质组学
    1.6 蛋白的亚细胞定位
        1.6.1 生物信息学方法预测候选效应子的亚细胞定位
        1.6.2 原生质体瞬时表达融合蛋白的亚细胞定位
    1.7 蛋白质相互作用
        1.7.1 酵母双杂交体系
        1.7.2 Pull-down技术
        1.7.3 串联亲和纯化技术
        1.7.4 双分子荧光互补实验(BiFC)
        1.7.5 免疫共沉淀(CoIP)
    1.8 本研究的目的意义
第二章 褐飞虱唾液蛋白质组研究
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验材料
            2.2.1.1 供试褐飞虱
            2.2.1.2 实验溶液、培养基
        2.2.2 实验方法
            2.2.2.1 褐飞虱唾液与口针鞘的收集
            2.2.2.2 样品蛋白的提取与纯化
            2.2.2.3 蛋白样品的SDS-PAGE检测
            2.2.2.4 质谱测序
            2.2.2.5 质谱数据分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 蛋白样品的SDS-PAGE检测
        2.3.2 质谱测序结果初步分析
        2.3.3 褐飞虱唾液蛋白的生物信息学分析
    2.4 小结与讨论
第三章 抗褐飞虱基因BPH9效应子的筛选
    3.1 前言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验材料
            3.2.1.1 供试褐飞虱
            3.2.1.2 烟草材料
            3.2.1.3 菌株、载体
            3.2.1.4 实验溶液、培养基
        3.2.2 实验方法
            3.2.2.1 大肠杆菌TOP 10感受态细胞的制备及转化
            3.2.2.2 碱裂解提取质粒法
            3.2.2.3 目的基因pEarleyGate100载体的构建
            3.2.2.4 农杆菌感受态制备
            3.2.2.5 目的基因电转化农杆菌感受态细胞
            3.2.2.6 烟草瞬时表达实验
            3.2.2.7 台盼蓝染色
            3.2.2.8 荧光素酶报告基因检测实验
            3.2.2.9 候选效应子对INF1引起的免疫反应的抑制
            3.2.2.10 候选效应子的亚细胞定位
    3.3 结果与分析
        3.3.1 目的基因的获得
        3.3.2 BPH9基因不同骨架载体对细胞死亡现象的影响
        3.3.3 BPH9基因特异效应子的筛选
        3.3.4 候选效应子基因功能的初步分析
            3.3.4.1 候选效应子的生物信息学分析
            3.3.4.2 台盼蓝染色
            3.3.4.3 Luciferase检测实验
            3.3.4.4 对PT-PCD的抑制作用
        3.3.5 候选效应子的亚细胞定位
            3.3.5.1 候选效应子亚细胞定位的生物信息学预测
            3.3.5.2 原生质体融合蛋白表达亚细胞定位
    3.4 小结与讨论
第四章 BPH9基因互作蛋白筛选
    4.1 前言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验材料
            4.2.1.1 菌株、载体
            4.2.1.2 酵母文库
            4.2.1.3 cDNA模板
            4.2.1.4 实验溶液、培养基
        4.2.2 实验方法
            4.2.2.1 水稻总RNA提取
            4.2.2.2 反转录cDNA的合成
            4.2.2.3 诱饵蛋白基因的扩增与载体构建
            4.2.2.4 酵母感受态细胞的制备及转化
            4.2.2.5 酵母表达检测
            4.2.2.6 对照实验
            4.2.2.7 自激活与毒性检测
            4.2.2.8 酵母筛库
            4.2.2.9 部分阳性克隆的测序
            4.2.2.10 候选蛋白基因的获得与载体构建
            4.2.2.11 候选蛋白在酵母真核细胞中的互作验证
    4.3 结果与分析
        4.3.1 酵母双杂交筛选水稻9311、NIL9-9311文库
        4.3.2 筛库阳性克隆初步分析
        4.3.3 候选蛋白酵母互作验证
    4.4 小结与讨论
第五章 总结与讨论
参考文献
附录
    附录一 质谱鉴定到的褐飞虱唾液蛋白
    附录二 候选效应子列表
作者简介与在读期间发表的论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]我国水稻产业发展现状、趋势及对策[J]. 于红燕,刘世义.  农村经济与科技. 2016(09)
[2]水稻抗褐飞虱基因及其育种应用研究进展[J]. 范峰峰,邱颖波,刘行丹,李绍清,刘建丰.  中国农学通报. 2014(06)
[3]水稻抗褐飞虱基因研究进展[J]. 祝莉莉,胡亮,杜波.  湖北农业科学. 2011(13)
[4]中国水稻科技发展战略[J]. 程式华,胡培松.  中国水稻科学. 2008(03)
[5]农学留学生与民国时期中国南方水稻的改良与推广[J]. 安宇,赵师红.  华南农业大学学报(社会科学版). 2007(01)
[6]大规模蛋白质相互作用研究方法进展[J]. 关薇,王建,贺福初.  生命科学. 2006(05)
[7]串联亲和纯化技术及其应用[J]. 洪奇华,陈安国.  细胞生物学杂志. 2006(05)



本文编号：3448710