戊唑醇诱导的烟曲霉对三唑类抗真菌药物的抗性

发布时间：2021-10-26 15:41

　　近年来,烟曲霉（Aspergillus fumigatus）对三唑类抗真菌药物的抗药性的报道愈发频繁,成为临床医学亟待解决的问题。农用三唑类杀菌剂广泛应用于农业生产,明确农用唑类杀菌剂的使用与临床抗性菌株的产生之间的关系,具有重要意义。本文从浙江省各地蔬菜大棚中分离得到4株敏感型野生烟曲霉（A.fumigatus）,通过戊唑醇诱导,4株敏感型野生烟曲霉均降低了对三唑类医药伏立康唑和伊曲康唑的敏感性,特别是对伏立康唑产生了较高的抗性（MIC=16 mg/L）。通过对诱导抗性菌株cyp51A基因的测序,发现由戊唑醇诱导产生抗性的4株菌株,cyp51A基因均发生TR46/Y121F/T289A突变。这一结果表明,戊唑醇等农用三唑类杀菌剂在农业生产中长期使用,可以诱导环境中的敏感型野生烟曲霉产生cyp51A突变（TR46/Y121F/T289A）,导致其对三唑类药物的抗性。利用基因重组技术构建了含TR46/Y121F/T289A突变的转化子,对比不含突变的转化子,含TR46/Y121F/T289A突变的转化子其对三唑类医药的抗性达到与诱导菌株相同的水平,即伏立康唑MIC=16mg/L,伊曲康唑... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 文献综述
    1.1 烟曲霉及其致病性
    1.2 三唑类抗真菌药物及其抗药性
    1.3 烟曲霉抗药性机制
        1.3.1 cyp51A基因突变
        1.3.2 非cyp51A基因突变
    1.4 烟曲霉抗性获得途径
    1.5 本研究的提出和意义
第2章 戊唑醇诱导的烟曲霉对药物的抗性
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 药品和试剂
        2.2.2 仪器和设备
        2.2.3 培养基
        2.2.4 菌种
    2.3 实验方法
        2.3.1 烟曲霉菌株的分离与鉴定
        2.3.2 戊唑醇诱导烟曲霉抗性实验
        2.3.3 诱导后烟曲霉菌株对伏立康唑、伊曲康唑的MIC变化
        2.3.4 诱导菌株cyp51A基因的变化
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 烟曲霉的鉴定
        2.4.2 戊唑醇诱导烟曲霉抗性
        2.4.3 诱导抗性菌株cyp51A基因的变化
    2.5 小结
第3章 CYP51A基因TR_(46)/Y121F/T289A突变与烟曲霉抗性的关系
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 化学试剂与抗生素
        3.2.2 仪器和设备
        3.2.3 培养基和缓冲液
        3.2.4 质粒和菌种
    3.3 实验方法
        3.3.1 载体构建流程示意
        3.3.2 构建中间载体质粒pBC-hygro-cyp51A
        3.3.3 表达载体pBC-hygro-cypbox的构建
        3.3.4 烟曲霉电击转化试验
        3.3.5 烟曲霉转化子的鉴定与分析
        3.3.6 转化子的MIC变化和cyp51A序列测序
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 构建中间载体质粒pBC-hygro-cyp51A
        3.4.2 表达载体pBC-hygro-cypbox的构建
        3.4.3 烟曲霉转化子的鉴定与分析
        3.4.4 转化子的MIC变化
    3.5 小结
第4章 烟曲霉抗性菌株CYP51A基因表达变化
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 菌株
        4.2.2 仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 总RNA的提取及完整性检测
        4.3.2 RNA的反转录及验证
        4.3.3 荧光定量法测定烟曲霉抗性菌株和敏感菌株cyp51A基因的变化
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 RNA样品质量检测
        4.4.2 内参基因片段的普通PCR扩增
        4.4.3 目的基因引物的选择
        4.4.4 Cyp51A基因的荧光定量PCR分析
    4.5 小结
第5章 抗药性与代谢作用的相关性及其遗传稳定性
    5.1 引言
    5.2 试验材料
        5.2.1 药品和试剂
        5.2.2 仪器和设备
        5.2.3 培养基和缓冲液
    5.3 实验方法
        5.3.1 抗性烟曲霉菌株对伏立康唑的代谢
        5.3.2 恢复敏感性
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 烟曲霉对伏立康唑的代谢
        5.4.2 恢复敏感性
    5.5 小结
第6章 结论
参考文献
攻读硕士学位期间主要的研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]烟曲霉关键致病因子研究进展[J]. 贾震宇,李德东,姜远英,王彦.  中国真菌学杂志. 2013(04)
[2]三唑类化合物研究与应用[J]. 白雪.  化工之友. 2007(07)
[3]唑类农药研究进展[J]. 金林红,宋宝安,杨松,胡德禹,刘刚.  贵州大学学报(自然科学版). 2003(01)
[4]微生物麦角固醇的研究进展[J]. 何秀萍,张博润.  微生物学通报. 1998(03)



本文编号：3459767