基于粗提物的水稻条纹病毒体外“抓帽”体系

发布时间：2021-10-30 13:33

　　【背景】布尼亚病毒目（Bunyavirales）和正黏病毒科（Orthomyxoviridae）病毒从帽子结构下游10—20个碱基处切割寄主mRNA,以5′端切割产物（帽子序列）作为引物起始自身基因组的转录,生成含一段异源帽子序列的病毒mRNA,这一过程称为"抓帽"。水稻条纹病毒（rice stripe tenuivirus, RSV）是一种布尼亚病毒,其"抓帽"机制还不甚清楚。【目的】研究RSV粗提物能否从溶液中的外源mRNA"抓帽",以建立一种便捷的体外体系,用于解析RSV"抓帽"和转录机制。【方法】以PEG沉淀和超速离心法粗提RSV,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和质谱技术分析粗提物成分。然后取少量粗提液,加入富含珠蛋白（globin）mRNA的兔网织红细胞裂解液（rabbit reticulocyte lysate,RCL）和合适浓度的金属离子配制体外"抓帽"体系。待体外反应结束,提取体系中总RNA,以巢式RT-PCR扩增含珠蛋白-αmRNA帽子序列的RSV mRNA,并对其进行克隆,通过序列分析比较RSV体外"抓帽"与体内"抓帽"的异同。【结果】从100 g感染R... 

【文章来源】：中国农业科学. 2020,53(21)北大核心CSCD

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

利用巢式RT-PCR扩增RSV从珠蛋白-α“抓帽”后合成的NP（转录自v RNA3）和NCP（转录自vc RNA4)m RNA

从100 g感染RSV的水稻叶片获得RSV粗提液2m L。取少量粗提液进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色后可观察到4条主要的蛋白条带，分子量依次约250、50、30和11 k D（图2）。质谱鉴定结果表明，条带1主要为光系统II相关蛋白，条带2主要为核酮糖1,5-二磷酸羧化酶（Ru Bis CO）大亚基和Ru Bis CO活化酶，条带3主要为RSV的NP，条带4主要为Ru Bis CO小亚基。由这些结果可知，RSV粗提物含大量杂质，而叶绿体是杂质成分的重要来源。RNA1编码的Rd Rp也是RSV的结构蛋白[31]，但可能因为含量太低，未观察到该蛋白对应的条带。2.2 RSV粗提物“抓帽”产物的检测

为验证RSV需要识别帽子结构才能利用溶液中的m RNA作为帽子序列供体，在反应体系中加入了不同浓度的帽子结构类似物m7G (5′) ppp (5′) G。如图3-B所示，m7G (5′) ppp (5′) G明显减少含珠蛋白-αm RNA帽子序列的NCP的生成。当m7G (5′) ppp (5′) G浓度为1.5 mmol·L-1时，目的条带基本消失。相反，m7G (5′) ppp (5′) G对反应后的RSV基因组RNA的检出性没有影响，表明m7G (5′) ppp (5′) G不会造成反应体系中RNA的降解。2.3 RSV粗提物“抓帽”产物分析

【参考文献】：
期刊论文
[1]水稻条纹病毒分子生物学研究进展[J]. 张恒木,孙焕然,王华弟,陈剑平.  植物保护学报. 2007(04)

硕士论文
[1]水稻条纹病毒mRNA 5’端“额外AC”的来源研究[D]. 和思淼.福建农林大学 2019



本文编号：3466819