细菌性甘薯茎腐病菌Dickeya dadantii的检测
发布时间：2021-11-04 12:32
Dickeya dadantii引起的甘薯茎腐病是甘薯的一种毁灭性细菌病害,在国内外均有发生。中国是最大的甘薯生产国,甘薯茎腐病严重损害甘薯产业的健康发展。甘薯茎腐病病原菌被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》,但目前国内外尚无针对D.dadantii的检测方法。本研究基于Dickeya属细菌全基因组序列,设计D.dadantii特异引物,建立特异灵敏的检测甘薯茎腐病菌的方法。本研究通过基因组系统发育分析和基因组相似度比较确定了Dickye 属内各种细菌的分类地位,用基于细菌全基因组序列高通量设计引物的程序流程（Find Differential Primers Pipeline）和泛基因组学分析发现种特有标志基因两种方法设计D.dadantii特异引物,PCR检测筛选出1对D.dadantii诊断引物Dad1-F（5’-CATATCAACCAGACCAGCCGTT）和 Dad1-R（5’-CGGCCTGCTTTTAAACAACGTATTA）,用该引物对能且只能从D.dadantii菌株中扩增到167-bp目的片段。基于该特异引物对建立了常规PCR、实时荧光定量PCR和免疫...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２?ＬＡＭＰ引物位置（摘自宋玉财等，２０１６）??Ｆｉｇ．?１．２?Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ＬＡＭＰ?ｐｒｉｍｅｒｓ??２．６重组酶聚合酶扩增技术（ＲＰＡ）??
?＿的编码基因）设计特异性引物，并在线预测引物的特异性，从２个基因分别获得??一对引物（表２．７）。??３．２．２．３引物特异性验证??选择?Ｄ．?油７?ＮＣＰＰＢ?８９８ｔ、ＮＣＰＰＢ?２９７６ｔ?和?ＣＺ１５０１?与近缘菌株?Ｄ．??ＮＣＰＰＢ?４４７９、Ｚ）．?ｃ／／训ｒｔｏ／ｃｏ／ａ?ＮＣＰＰＢ?３５３０用于初筛由Ｄ．也也《＂／特有基因设计??的２对引物。只有引物对Ｄａｄ?１?－Ｆ／?Ｄａｄ?１－Ｒ（针对蛋白ＷＰ＿０７７２４５５１７的编码基因）??的扩增结果呈现Ｄ．也也咐／／特异性，即只从３个Ｄ．而而咐／／菌株扩增得到１６７?ｂｐ??目的片段。将所得的３个ＰＣＲ产物回收测序，与目的片段序列对比分析相似度??达１００％，表明所得产物为目的片段。??进一步用Ｄａｄｌ－Ｆ／Ｄａｄｌ－Ｒ从１９个菌株进行ＰＣＲ扩增，依然只从３个Ｄ．??而也扣／／菌株扩增得到１６７?ｂｐ目的片段，而从其他种属菌株中没有扩增出产物（图??２．３），证实引物对Ｄａｄｌ－Ｆ／Ｄａｄ?１－Ｒ是Ｄ．而而油７特异引物。??卜??
?第二章细菌性甘薯茎腐病菌ｄａｃ／ｃｒ？／／／的检测??用引物Ｄａｄｌ－Ｆ／Ｄａｄｌ－Ｒ以菌株ＣＺ１５０１的基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ，能??从最低５０?ｐｇ．ｎＬ－１的ＤＮＡ中扩增到１６７?ｂｐ的目的条带（图２．４）。??ＪＭ??图２．４琼脂糖凝胶电泳示用Ｄ．心心咐／／特异引物从不同浓度基因组ＤＮＡ扩增的产物??Ｆｉｇ．?２．４?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｆｒｏｍ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ??ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｂａｃｔｅｒｉａｌ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ?ｕｓｉｎｇ?ｔｈｅ?Ａ?＾＂“＂＂＂／／－ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ??１３．１．２常规ＰＣＲ方法检测接种样品??■囉??１６７?ｂｐ??（ｃ）??１６７?ｂｐ??图２．５琼脂糖凝胶电泳示用Ｚ）．心ｒｆｒｍｒｆ／特异引物从不同浓度土壤ＤＮＡ?（Ａ）、甘薯茎??ＤＮＡ?（Ｂ）、甘薯块根ＤＮＡ?（Ｃ）扩增的产物??Ｆｉｇ．?２．５?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｆｒｏｍ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ??ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ＤＮＡ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｓｏｉｌ?（Ａ），?ｓｗｅｅｔ?ｐｏｔａｔｏ?ｓｔｅｍ?（Ｂ），?ａｎｄ?ｓｗｅｅｔ?ｐｏｔａｔｏ?ｔｕｂｅｒ??（Ｃ）?ｕｓｉｎｇ?ｔｈｅ?Ｄ．?ｒｆｒｔ＾ｍ／／７－ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ??以接种样品提取的ＤＮＡ为模板，采用常规ＰＣＲ方法进行灵敏度测定。如图??２．５所示
【参考文献】：
期刊论文
[1]甘薯茎腐病症状及其病原鉴定[J]. 沈肖玲,林钗,钱俊婷,仇智灵,陈江彬,孙超,易建平,楼兵干. 植物病理学报. 2018(01)
[2]甘薯茎腐病的发生危害及防控对策[J]. 杨晓,张敏荣,余继华,卢璐,陶健. 农业与技术. 2017(02)
[3]环介导等温扩增技术研究进展[J]. 宋玉财,王彬,王官晓,李鹏,刘洪明,于晓云,于小川,徐晓静,王俊卿. 中国动物检疫. 2016(06)
[4]细菌性软腐病菌Dickeya致病机理的研究进展[J]. 周佳暖,姜子德,张炼辉. 植物病理学报. 2015(04)
[5]河北省甘薯茎腐病研究初报[J]. 高波,王容燕,马娟,李秀花,陈书龙. 植物保护. 2015(03)
[6]免疫捕捉PCR和经典PCR方法检测水稻细菌性谷枯病菌灵敏性比较[J]. 罗金燕,陈磊,秦萌,赵玉强,余慧. 浙江农业学报. 2014(02)
[7]甘薯茎腐病的研究进展[J]. 黄立飞,罗忠霞,房伯平,李开绵,陈景益,黄实辉. 植物保护学报. 2014(01)
[8]河南省甘薯茎腐病的分离与鉴定[J]. 秦素研,黄立飞,葛昌斌,刘志坚,张勇跃,李建国,房伯平. 作物杂志. 2013(06)
[9]中国甘薯产业及产业技术的发展与展望[J]. 马代夫,李强,曹清河,钮福祥,谢逸萍,唐君,李洪民. 江苏农业学报. 2012(05)
[10]菊欧文氏菌分子检测技术的研究[J]. 刘鹏,黄国明,刘勇,崔铁军. 植物病理学报. 2007(06)
博士论文
[1]泛基因组学分析方法开发及应用[D]. 赵永兵.中国科学院北京基因组研究所 2014
本文编号：3475733
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２?ＬＡＭＰ引物位置（摘自宋玉财等，２０１６）??Ｆｉｇ．?１．２?Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ＬＡＭＰ?ｐｒｉｍｅｒｓ??２．６重组酶聚合酶扩增技术（ＲＰＡ）??
?＿的编码基因）设计特异性引物，并在线预测引物的特异性，从２个基因分别获得??一对引物（表２．７）。??３．２．２．３引物特异性验证??选择?Ｄ．?油７?ＮＣＰＰＢ?８９８ｔ、ＮＣＰＰＢ?２９７６ｔ?和?ＣＺ１５０１?与近缘菌株?Ｄ．??ＮＣＰＰＢ?４４７９、Ｚ）．?ｃ／／训ｒｔｏ／ｃｏ／ａ?ＮＣＰＰＢ?３５３０用于初筛由Ｄ．也也《＂／特有基因设计??的２对引物。只有引物对Ｄａｄ?１?－Ｆ／?Ｄａｄ?１－Ｒ（针对蛋白ＷＰ＿０７７２４５５１７的编码基因）??的扩增结果呈现Ｄ．也也咐／／特异性，即只从３个Ｄ．而而咐／／菌株扩增得到１６７?ｂｐ??目的片段。将所得的３个ＰＣＲ产物回收测序，与目的片段序列对比分析相似度??达１００％，表明所得产物为目的片段。??进一步用Ｄａｄｌ－Ｆ／Ｄａｄｌ－Ｒ从１９个菌株进行ＰＣＲ扩增，依然只从３个Ｄ．??而也扣／／菌株扩增得到１６７?ｂｐ目的片段，而从其他种属菌株中没有扩增出产物（图??２．３），证实引物对Ｄａｄｌ－Ｆ／Ｄａｄ?１－Ｒ是Ｄ．而而油７特异引物。??卜??
?第二章细菌性甘薯茎腐病菌ｄａｃ／ｃｒ？／／／的检测??用引物Ｄａｄｌ－Ｆ／Ｄａｄｌ－Ｒ以菌株ＣＺ１５０１的基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ，能??从最低５０?ｐｇ．ｎＬ－１的ＤＮＡ中扩增到１６７?ｂｐ的目的条带（图２．４）。??ＪＭ??图２．４琼脂糖凝胶电泳示用Ｄ．心心咐／／特异引物从不同浓度基因组ＤＮＡ扩增的产物??Ｆｉｇ．?２．４?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｆｒｏｍ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ??ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｂａｃｔｅｒｉａｌ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ?ｕｓｉｎｇ?ｔｈｅ?Ａ?＾＂“＂＂＂／／－ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ??１３．１．２常规ＰＣＲ方法检测接种样品??■囉??１６７?ｂｐ??（ｃ）??１６７?ｂｐ??图２．５琼脂糖凝胶电泳示用Ｚ）．心ｒｆｒｍｒｆ／特异引物从不同浓度土壤ＤＮＡ?（Ａ）、甘薯茎??ＤＮＡ?（Ｂ）、甘薯块根ＤＮＡ?（Ｃ）扩增的产物??Ｆｉｇ．?２．５?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｆｒｏｍ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ??ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ＤＮＡ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｓｏｉｌ?（Ａ），?ｓｗｅｅｔ?ｐｏｔａｔｏ?ｓｔｅｍ?（Ｂ），?ａｎｄ?ｓｗｅｅｔ?ｐｏｔａｔｏ?ｔｕｂｅｒ??（Ｃ）?ｕｓｉｎｇ?ｔｈｅ?Ｄ．?ｒｆｒｔ＾ｍ／／７－ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ??以接种样品提取的ＤＮＡ为模板，采用常规ＰＣＲ方法进行灵敏度测定。如图??２．５所示
【参考文献】：
期刊论文
[1]甘薯茎腐病症状及其病原鉴定[J]. 沈肖玲,林钗,钱俊婷,仇智灵,陈江彬,孙超,易建平,楼兵干. 植物病理学报. 2018(01)
[2]甘薯茎腐病的发生危害及防控对策[J]. 杨晓,张敏荣,余继华,卢璐,陶健. 农业与技术. 2017(02)
[3]环介导等温扩增技术研究进展[J]. 宋玉财,王彬,王官晓,李鹏,刘洪明,于晓云,于小川,徐晓静,王俊卿. 中国动物检疫. 2016(06)
[4]细菌性软腐病菌Dickeya致病机理的研究进展[J]. 周佳暖,姜子德,张炼辉. 植物病理学报. 2015(04)
[5]河北省甘薯茎腐病研究初报[J]. 高波,王容燕,马娟,李秀花,陈书龙. 植物保护. 2015(03)
[6]免疫捕捉PCR和经典PCR方法检测水稻细菌性谷枯病菌灵敏性比较[J]. 罗金燕,陈磊,秦萌,赵玉强,余慧. 浙江农业学报. 2014(02)
[7]甘薯茎腐病的研究进展[J]. 黄立飞,罗忠霞,房伯平,李开绵,陈景益,黄实辉. 植物保护学报. 2014(01)
[8]河南省甘薯茎腐病的分离与鉴定[J]. 秦素研,黄立飞,葛昌斌,刘志坚,张勇跃,李建国,房伯平. 作物杂志. 2013(06)
[9]中国甘薯产业及产业技术的发展与展望[J]. 马代夫,李强,曹清河,钮福祥,谢逸萍,唐君,李洪民. 江苏农业学报. 2012(05)
[10]菊欧文氏菌分子检测技术的研究[J]. 刘鹏,黄国明,刘勇,崔铁军. 植物病理学报. 2007(06)
博士论文
[1]泛基因组学分析方法开发及应用[D]. 赵永兵.中国科学院北京基因组研究所 2014
本文编号：3475733
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