棉铃虫烯醇化酶基因的克隆表达及其功能的初步分析

发布时间：2021-11-17 01:16

　　烯醇化酶（enolase,2-phospho-D-glycerate hydrolyase）作为糖酵解过程的限速酶,能催化磷酸甘油（PGA）向磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的转化,也能催化其逆向反应过程,因此烯醇化酶在细胞能量代谢过程中起着重要的作用。越来越多的研究证明烯醇化酶属于一个新的蛋白家族,称为兼职功能蛋白（moonlighting protein）,具有多种与细胞病理生理等活动相关的功能,例如参与细胞凋亡、炎症反应以及病菌感染等过程。棉铃虫（Helicoverpa armigera（Lepidoptera:Noctuidae））作为世界性重要的农业害虫,目前主要利用Bt（Bacillus thuringiensis,Bt）毒素来控制其为害。然而随着Bt棉的大面积推广,棉铃虫对Bt毒素产生的抗性机制将会影响Bt棉长期有效的应用,所以了解烯醇化酶与棉铃虫Bt抗性之间的关系是十分重要的。本研究以棉铃虫作为实验对象,首次克隆得到该基因完整的编码区序列,开放阅读框长1302bp,编码432个氨基酸;该基因在许多物种中均存在且高度保守,与同属夜蛾科的斜纹夜蛾（Spodoptera litur... 

【文章来源】：华中师范大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

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图１．２人类ＥＮＯｌ的分子构象（Ａ）以及活性位点（Ｂ）?１１２１??

，??ｔｈｅ?ｄｉｍｅｒ?ｉｎｔｅｒｆａｃｅ?ＨＨ，ＡＶ，Ａ，Ｎ，ＬＡ，?２０６－２０７，２１４，２１６，４０５??（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ?Ｎ，ＬＲＥ?－４０６，４１２－４１３，４０９，４１６??ｓｉｔｅ）??膜结合位点?ＡＡＶＰＳＧＡＴＧＶ?３３－４３??Ｔｈｅ?ａｓｓｕｍｅｄ?ｍｅｍｂｒａｎｅ??ｒｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ??Ｅｎｏｌａｓｅ＿Ｎ?＾｜＾Ｐ＾＾｜Ｅｎｏｌａｓｅ＿Ｃ??．?????〇?１００?２００?３００?４００??图４．２棉铃虫烯醇化酶保守的结构域Ｅｎｏｌａｓｅ－Ｎ和Ｅｎｏｌａｓｅ－Ｃ??Ｆｉｇ．?４．２?Ａｎａｌｙｓｅｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｄｏｍａｉｎｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｅｎｏｌａｓｅ?ｆｒｏｍ?Ｈ．?ａｒｍｉｇｅｒａ??２９??

文??ＭＡＳＴＥＲ＇Ｓ?ＴＨＥＳＩＳ??Ｅｇｇ：卵；１?ｉｎｓｔａｒ：?１?龄幼虫；２?ｉｎｓｔａｒ：?２?龄幼虫；３?ｉｎｓｔａｒ：?３?龄幼虫；４?ｉｎｓｔａｒ：?４??龄幼虫；５?ｉｎｓｔａｒ：?５?龄幼虫；Ｐｕｐａ：蛹；ｆｅｍａｌｅ?ａｄｕｌｔｓ：雌性成虫；Ｍａｌｅ?ａｄｕｌｔｓ：雄??性成虫??４．５棉铃虫烯醇化酶在细胞内的定位情况??为了观察棉铃虫烯醇化酶在昆虫细胞内的分布情况，将构建好的Ｐ??ｉｅ２－ＥＧＦＰ－Ｎｌ－ｅｎｏ转染Ｈｉ５细胞系，经过染核试剂染核制片后观察（图４．８），结果??显示，融合蛋白分布于整个细胞，与信息学分析相一致，但在细胞核中的含量明显??高于细胞质中，并且部分融合蛋白在细胞质中聚集，形成了一些点状结构。??Ｎｕｃｌｅｕｓ?Ｅｎｏｌａｓｅ－ＧＦＰ?Ｍｅｒｇｅｄ??■■■??图４．８棉铃虫烯醇化酶在ＢＴＩ－Ｔｎ－５Ｂｌ－４?（Ｈｉ５）细胞中的定位??Ｆｉｇ．４．８?Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ?ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｈａｒｍ－ｅｎｏｌｓｅ－ＧＦＰ?ｉｎ?ｉｎｓｅｃｔ?ｃｅｌｌｓ?ＢＴＩ－Ｔｎ－５Ｂｌ－４?（Ｈｉ５）．??Ｎｕｃｌｅｕｓ：细胞核指不剂荧光图?Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｐｈｏｔｏ?ｗｉｔｈ?ｎｕｌｅａｒ?ｓｔａｉｎ；?Ｅｎｏｌａｓｅ－ＧＦＰ：??Ｅｎｏｌａｓｅ－ＧＦＰ?融合蛋白的焚光图?Ｅｎｏｌａｓｅ－ＧＦＰ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｐｈｏｔｏ?ｕｎｄｅｒ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；??Ｍｅｒｇｅｄ：焚光和细胞核指不剂拼和图Ｍｅｒｇｅｄ?Ｐｉｃｔｕｒｅｓ．??４．６棉铃虫烯醇化酶蛋白的表达、纯化和质谱鉴定??４．６．１诱导表达棉铃虫烯醇化酶蛋白??构建完成的含ｐＥＴ３０ａ（

【参考文献】：
期刊论文
[1]α-烯醇化酶在鼻咽癌中的表达[J]. 程超,龙孝斌,李欣,谢民强,郭梦和.  临床耳鼻咽喉头颈外科杂志. 2011(12)
[2]α烯醇化酶——古老的蛋白,崭新的功能[J]. 朱理安,方宁远.  国际病理科学与临床杂志. 2007(04)
[3]棉铃虫对Bt的抗性筛选及交互抗性研究[J]. 梁革梅,谭维嘉,郭予元.  中国农业科学. 2000(04)
[4]人工饲养棉铃虫技术的改进[J]. 梁革梅,谭维嘉,郭予元.  植物保护. 1999(02)



本文编号：3499938