检测狐狸微孢子虫病胶体金试纸条的制备

发布时间：2021-12-27 21:27

　　微孢子虫（Microsporidia）是一类属于微孢子虫目的真核微生物,能引发宿主的脑炎、肠炎及肾炎等疾病,宿主范围广泛。先前的研究已证明狐狸感染的微孢子虫是兔脑炎微孢子虫,感染的幼狐在分窝前后发病,食欲不济、嗜睡、毛皮粗糙,严重的还会出现神经系统疾病及肉芽肿性脑炎,给狐狸养殖业造成巨大损失。我们的研究表明可利用基因重组技术表达微孢子虫孢壁蛋白SWP1建立ELISA诊断方法。但它常依赖实验室专有的仪器、设备与人员。因此建立一种便宜、快速、准确的诊断方法意义重大。本研究以提纯的狐狸IgG为抗原,免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,制备杂交瘤,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆,得到3株能稳定分泌针对狐狸IgG的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为E2、1E3、2G10。Western Blot结果显示,这3株单抗能和狐狸IgG特异性结合。抗体亚型鉴定表明,E2、1E3和2G10的重链均为IgG1,轻链均为Kappa链。生产提纯的1E3杂交瘤腹水单抗经Western Blot检测发现效价可达6000。将微孢子虫孢壁蛋白SWP1基因片段克隆到含GST标签的PcoldⅢ载体中,利用原核表达系... 

【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 微孢子虫概述
        1.1.1 微孢子虫的分类地位
        1.1.2 微孢子虫的生活史
        1.1.3 微孢子虫孢子形态
        1.1.4 微孢子虫的感染机制
        1.1.5 微孢子虫蛋白的研究
        1.1.6 微孢子虫传播方式及兔脑炎微孢子虫重要宿主感染情况
        1.1.7 兔脑炎微孢子虫的分子流行病学
        1.1.8 微孢子虫诊断技术
    1.2 单克隆抗体技术
        1.2.1 杂交瘤技术原理
        1.2.2 单克隆抗体应用
    1.3 胶体金免疫层析技术
        1.3.1 胶体金
        1.3.2 胶体金免疫试纸条
    1.4 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 血清、细胞与菌种
        2.1.2 实验动物
        2.1.3 主要试剂与溶液
        2.1.4 主要仪器与耗材
    2.2 实验方法
        2.2.1 狐狸IgG的制备与纯化
        2.2.2 抗原乳化
        2.2.3 动物免疫
        2.2.4 细胞融合
        2.2.5 阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆化
        2.2.6 单克隆抗体细胞株上清液Western Blot分析
        2.2.7 单克隆抗体细胞株的冻存与复苏
        2.2.8 单克隆抗体的大量生产及纯化
        2.2.9 单克隆抗体亚类的鉴定
        2.2.10 Western Blot鉴定腹水提纯单抗特异性
        2.2.11 SWP1蛋白的表达与纯化及ELISA检测
        2.2.12 兔抗狐狸IgG多抗的制备
        2.2.13 胶体金的制备
        2.2.14 胶体金抗体最小标记量的确定
        2.2.15 胶体金标记单抗 1E3的制备
        2.2.16 试纸条的组装及结果判定
        2.2.17 特异性试验
        2.2.18 重复性试验
        2.2.19 灵敏性试验
        2.2.20 稳定性试验
3 实验结果
    3.1 狐狸IgG的提纯
    3.2 细胞融合
    3.3 抗原的最佳包被浓度的确定
    3.4 单克隆抗体细胞株上清Western Blot结果
    3.5 单克隆抗体亚型鉴定
    3.6 腹水单抗的纯化
    3.7 SWP1蛋白的浓度与ELISA检测结果
    3.8 兔子多抗琼脂扩散试验
    3.9 胶体金标记的最佳蛋白量
    3.10 检测线SWP1蛋白及质控线兔抗狐IgG多抗的浓度确定
    3.11 试纸条结果判定
    3.12 特异性试验
    3.13 重复性试验
    3.14 灵敏性试验
    3.15 稳定性试验
4 讨论
    4.1 动物免疫
    4.2 细胞融合
    4.3 制备饲养细胞
    4.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆
    4.5 抗体的大量制备与纯化
    4.6 胶体金试纸条的制备
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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[2]鸡毒支原体胶体金免疫层析试纸条的研制和初步应用[J]. 宁官保,刘国莉,张鼎,李宏全,马海利,高荣琨,郝卫芳,高文伟,赵宇军,高诗敏,李建慧,李桂兰,闫芳,田文霞.  动物医学进展. 2015(05)
[3]黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA检测技术研究[J]. 谢珲,章先,王歆,凡鹏程,时玉菲,方维焕.  微生物学通报. 2015(10)
[4]布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析法快速检测技术的建立[J]. 程婷婷,石峰,陈创夫,王远志,张辉,李志强,鲁芝子,监通,马齐蔓.  中国病原生物学杂志. 2014(02)
[5]A群猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 迟延彬,陈建飞,时洪艳,张鑫,石达,李长龙,韩斅,陈洪岩,冯力.  中国畜牧兽医. 2014(02)
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本文编号：3552765