Bt Cry1类毒素单克隆抗体和单链抗体的制备及其活性分析
发布时间：2022-01-07 17:12
Bt Cry1类毒素是由苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）在产孢过程中产生,并对鳞翅目昆虫幼虫有杀虫活性的一类毒素,主要包括Cry1Aa,Cry1Ab,Cry1Ac,Cry1B,Cry1C,Cry1E和Cry1F等。因为哺乳动物体内缺少毒素的受体,通常情况下认为Cry毒素对人类和家畜是无毒的,所以Bt基因被广泛的应用于转基因作物中,如玉米、大豆和土豆等。但随着转基因作物种植面积的逐年扩大,Bt基因抗虫植物开始作为人类食物及动物饲料应用,人们对它的环境生态安全性以及其对人类和其它哺乳动物的安全隐患的担忧逐渐增加。因此,对转Bt基因作物Cry毒素的表达量和食品中的残留量需要建立灵敏、可靠、方便的检测方法。本论文依托成熟的单克隆抗体制备、基因工程和噬菌体展示技术制备Bt Cry1类毒素的单克隆抗体和单链抗体,并对获得的抗体材料进行活性分析,建立Cry1类毒素的免疫学检测方法,将其应用于实际样品的检测当中。主要内容包括以下几个方面:1.抗Bt Cry1类毒素广谱单克隆抗体的制备及检测方法的建立通过比较七种 Cry1 类毒素（Cry1Aa,Cry1Ab,Cr...
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：172 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１抗体及其片段的基本结构??Ｆｉｇ．?１－１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ?ｏｆ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ａｎｄ?ｉｔｓ?ｆｒａｇｍｅｎｔｓ??
胞易于在体外无限增殖的特性，??又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培??养，可形成单细胞系，即单克拢利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量??的、高浓度的、非常均一的抗体，称为单克隆抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性??等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保??持同样的结构与机能。这种技术即称为单克隆抗体技术。这项新技术从根本上解决??了在抗体制备过程中长期存在的特异性和可重复性问题。单克隆抗体的制备流程如??图１－２所示，首先选择合适的动物（常用小鼠，近年来也有用大白兔制备单克隆抗??体的报道）进行免疫；中间取血清测定效价，当效价达到理想值时，拉颈处死小鼠，??取脾脏制备脾细胞并与生长状态良好的骨髓瘤细胞ＳＰ２／０进行融合；对融合成功的??杂交瘤细胞进行亚克隆鉴定，筛选出能够特异性分泌单一抗体的杂交瘤细胞株。??廳＿?体外培养??￣ｉ?「、培养液??０?１?是取??选择培养??亚克隆筛选总?（儿人??—？?〇＞?？??？?６＇?—？??？?＆?＾?＆?单克隆抗体??－一?＿?ｆｔ?＾?Ａ?纟日＿合?单雜纟０＿?／ＣｉＶＷＢ．??骨髓瘤细胞ＳＰ２０??图１－２单克隆抗体制备流程??Ｆｉｇ．?１－２?Ｇｅｎｅｒａｌ?ｐｒｏｔｏｃｏｌ?ｏｆ?ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ?ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ??２．２．２．２多克隆抗体??抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个Ｂ??淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体，而由多种抗原决定簇刺激机??体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，
前转基因产品检测中最常用的检测方法是双抗夹心ＥＬＩＳＡ法，包括商品??化的转基因作物检测试剂盒，一般也是采用双抗夹心ＥＬＩＳＡ。??（ａ）直接法：以包被抗原：为例??、＾?洗涤?、一加酶底物??抗原包被酶标板加酸标记抗体?显色??（ｂ）间接法??洗涤洗涤?加酶底物??抗原包被醜标板?加待检抗体?加酶标记二抗?显色??（ｃ）双抗体夹心法：以直接夹心法为例??洗綠?洗潘＾加酶底物??Ｗ?＾￣Ｗ?＊?剛?＾?國??抗体包被酶标板?加待检抗原?加酶标记二抗?显色??图１－３?ＥＬＩＳＡ法示意图??Ｆｉｇ．?１－３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＥＬＩＳＡ??２．２．４．３胶体金免疫层析试纸条??胶体金免疫层析分析（Ｇｏｌｄ?ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ?ａｓｓａｙ，?ＧＩＣＡ）是在?ＥＬＩＳＡ??方法基础上发展起来的一种新型快速免疫测定技术。该方法以ＮＣ膜为固相载体，??待检溶液通过层析作用横向流动，只需将待检溶液加在免疫层析条的样品垫上即可，??不需要任何其他试剂和操作。该方法与传统的Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ等检测方法相??１３??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Cry2Aa毒素结合十二肽的筛选与鉴定[J]. 武爱华,张霄,刘媛,赵扬,赵岩岩,张存政,谢雅晶,刘贤金. 江苏农业学报. 2015(04)
[2]基于实时荧光定量PCR对转基因樱桃番茄外源基因拷贝数的检测[J]. 苏慧慧,李涛,谢雯琦,黎振兴,李植良,王永飞. 分子植物育种. 2015(02)
[3]基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定[J]. 张留圈,张霄,刘媛,徐重新,张存政,谢雅晶,寇莉萍,刘贤金. 中国农业科学. 2014(09)
[4]大肠杆菌O157:H7荧光微球免疫层析试纸条的研制[J]. 解泉源,赖卫华,刘春梅,孙吉昌,邓省亮,刘成伟,魏华,游兴勇,熊勇华. 食品科学. 2013(16)
[5]基于定点突变的抗克百威单链抗体的亲和力成熟[J]. 邓龙,肖治理,董洁娴,王弘,杨武英,谢曦,杨金易,沈玉栋,孙远明. 高等学校化学学报. 2012(11)
[6]Homology Modeling of Mosquitocidal Cry30Ca2 of Bacillus thuringiensis and Its Molecular Docking with N-acetylgalactosamine[J]. ZHAO Xin Min 1,2 , ZHOU Pan Deng 1 and XIA Li Qui 2,# 1. Department of Chemistry and Environmental Engineering, Hunan City University, Yiyang 413000, Hunan, China; 2. Key Laboratory of Microbial Molecular Biology of Hunan Province, College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan, China. Biomedical and Environmental Sciences. 2012(05)
[7]多重PCR检测转基因水稻的转基因成分[J]. 魏霜,陈贞,芦春斌,马骏,白卫滨,吴希阳. 食品科学. 2012(12)
[8]单域抗体研究进展[J]. 潘欣,潘伯驹,蔡家麟,李晗,王颖,蓝乐夫,廖万清. 生命科学. 2012(05)
[9]毒素DON单链抗体的同源建模及与DON结合的分子模拟研究[J]. 郑蓉,吕暾. 化学学报. 2011(23)
[10]免疫层析试纸条技术及其在食源性致病菌检测中应用的研究进展[J]. 李怀明,许恒毅,熊勇华. 食品科学. 2011(17)
本文编号：3574938
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：172 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１抗体及其片段的基本结构??Ｆｉｇ．?１－１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ?ｏｆ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ａｎｄ?ｉｔｓ?ｆｒａｇｍｅｎｔｓ??
胞易于在体外无限增殖的特性，??又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培??养，可形成单细胞系，即单克拢利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量??的、高浓度的、非常均一的抗体，称为单克隆抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性??等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保??持同样的结构与机能。这种技术即称为单克隆抗体技术。这项新技术从根本上解决??了在抗体制备过程中长期存在的特异性和可重复性问题。单克隆抗体的制备流程如??图１－２所示，首先选择合适的动物（常用小鼠，近年来也有用大白兔制备单克隆抗??体的报道）进行免疫；中间取血清测定效价，当效价达到理想值时，拉颈处死小鼠，??取脾脏制备脾细胞并与生长状态良好的骨髓瘤细胞ＳＰ２／０进行融合；对融合成功的??杂交瘤细胞进行亚克隆鉴定，筛选出能够特异性分泌单一抗体的杂交瘤细胞株。??廳＿?体外培养??￣ｉ?「、培养液??０?１?是取??选择培养??亚克隆筛选总?（儿人??—？?〇＞?？??？?６＇?—？??？?＆?＾?＆?单克隆抗体??－一?＿?ｆｔ?＾?Ａ?纟日＿合?单雜纟０＿?／ＣｉＶＷＢ．??骨髓瘤细胞ＳＰ２０??图１－２单克隆抗体制备流程??Ｆｉｇ．?１－２?Ｇｅｎｅｒａｌ?ｐｒｏｔｏｃｏｌ?ｏｆ?ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ?ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ??２．２．２．２多克隆抗体??抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个Ｂ??淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体，而由多种抗原决定簇刺激机??体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，
前转基因产品检测中最常用的检测方法是双抗夹心ＥＬＩＳＡ法，包括商品??化的转基因作物检测试剂盒，一般也是采用双抗夹心ＥＬＩＳＡ。??（ａ）直接法：以包被抗原：为例??、＾?洗涤?、一加酶底物??抗原包被酶标板加酸标记抗体?显色??（ｂ）间接法??洗涤洗涤?加酶底物??抗原包被醜标板?加待检抗体?加酶标记二抗?显色??（ｃ）双抗体夹心法：以直接夹心法为例??洗綠?洗潘＾加酶底物??Ｗ?＾￣Ｗ?＊?剛?＾?國??抗体包被酶标板?加待检抗原?加酶标记二抗?显色??图１－３?ＥＬＩＳＡ法示意图??Ｆｉｇ．?１－３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＥＬＩＳＡ??２．２．４．３胶体金免疫层析试纸条??胶体金免疫层析分析（Ｇｏｌｄ?ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ?ａｓｓａｙ，?ＧＩＣＡ）是在?ＥＬＩＳＡ??方法基础上发展起来的一种新型快速免疫测定技术。该方法以ＮＣ膜为固相载体，??待检溶液通过层析作用横向流动，只需将待检溶液加在免疫层析条的样品垫上即可，??不需要任何其他试剂和操作。该方法与传统的Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ等检测方法相??１３??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Cry2Aa毒素结合十二肽的筛选与鉴定[J]. 武爱华,张霄,刘媛,赵扬,赵岩岩,张存政,谢雅晶,刘贤金. 江苏农业学报. 2015(04)
[2]基于实时荧光定量PCR对转基因樱桃番茄外源基因拷贝数的检测[J]. 苏慧慧,李涛,谢雯琦,黎振兴,李植良,王永飞. 分子植物育种. 2015(02)
[3]基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定[J]. 张留圈,张霄,刘媛,徐重新,张存政,谢雅晶,寇莉萍,刘贤金. 中国农业科学. 2014(09)
[4]大肠杆菌O157:H7荧光微球免疫层析试纸条的研制[J]. 解泉源,赖卫华,刘春梅,孙吉昌,邓省亮,刘成伟,魏华,游兴勇,熊勇华. 食品科学. 2013(16)
[5]基于定点突变的抗克百威单链抗体的亲和力成熟[J]. 邓龙,肖治理,董洁娴,王弘,杨武英,谢曦,杨金易,沈玉栋,孙远明. 高等学校化学学报. 2012(11)
[6]Homology Modeling of Mosquitocidal Cry30Ca2 of Bacillus thuringiensis and Its Molecular Docking with N-acetylgalactosamine[J]. ZHAO Xin Min 1,2 , ZHOU Pan Deng 1 and XIA Li Qui 2,# 1. Department of Chemistry and Environmental Engineering, Hunan City University, Yiyang 413000, Hunan, China; 2. Key Laboratory of Microbial Molecular Biology of Hunan Province, College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan, China. Biomedical and Environmental Sciences. 2012(05)
[7]多重PCR检测转基因水稻的转基因成分[J]. 魏霜,陈贞,芦春斌,马骏,白卫滨,吴希阳. 食品科学. 2012(12)
[8]单域抗体研究进展[J]. 潘欣,潘伯驹,蔡家麟,李晗,王颖,蓝乐夫,廖万清. 生命科学. 2012(05)
[9]毒素DON单链抗体的同源建模及与DON结合的分子模拟研究[J]. 郑蓉,吕暾. 化学学报. 2011(23)
[10]免疫层析试纸条技术及其在食源性致病菌检测中应用的研究进展[J]. 李怀明,许恒毅,熊勇华. 食品科学. 2011(17)
本文编号：3574938
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