番木瓜畸形花叶病毒在寄主基因功能鉴定及交叉保护中的应用
发布时间：2022-01-11 07:37
番木瓜（Carica papaya L.）是一种广受人们喜爱的水果和重要的热带经济作物,但番木瓜果树自身抗病毒力较弱,很容易受到病毒的侵害,其中番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）是一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害,近年来发病率逐年递增,已成为继木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）为害最严重的病毒病害。目前,PLDMV在栽培技术上如PRSV一样也很难通过化学防治的方法予以防控。所以,急需寻找到一种更为安全且广谱的抗病毒新策略。而这种抗病毒新策略的获得需要在PLDMV致病机理、PLDMV弱毒株“植物疫苗”及基因功能鉴定等方面取得一定的工作积累。本研究就是基于这些关键技术环节开展了系列的研究,以期为开辟安全广谱的抗PLDMV新策略奠定良好的理论和技术基础。开展上述这些研究工作,都会涉及植物病毒表达载体构建的关键环节,这是研究植物病毒的基础,也是最为关键的内容之一。由于许多植物病毒基因组较大,且会在大肠杆菌体内产生毒性,所以带有病毒全长表达载体的构建一直是研究工作的难点。本研究通过将病毒全长...
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：135 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
PLDMV基因组序列
海南大学博士学位论文8中（GomordV，et.al，1984）。接下来，外国学者Ahlquist在80年代应用BMV-Russian株系研制了两种载体，将氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因进行表达（Alquist，P，et.al，1986）。现如今，RNA病毒受到广泛关注并取得了很多研究成果，RNA和DNA病毒都能够以表达载体的形式进行更深入的分析（Boyer，RL，et.al，2004）。（1）利用植物病毒表达外源基因的研究进展在研究植物病毒与寄主的互作方面，植物病毒表达载体最广泛地应用是在植物病毒中插入GFP或者其他荧光报告基因，在插入报告基因的植物病毒侵染植株后出现症状时，染病的植株在特定紫外灯光照射下，可以显著的观察到病毒在植物中的累积部位所发出的荧光，可用于研究病毒在寄主中的复制，积累与运动示踪（如图2）。图2UV灯照射下PLDM模式PLDMVV-GFP感病植株与健株对照Fig.2PLMV-GFPplantsandhealthyplantsunderUVLAMP而在病毒基因片段中插入抗体标签则还可以进行免疫共沉淀实验。在FeRNAndoMartínez的研究中，将烟草蚀纹病毒中的P1蛋白插入Strep标签并侵染植物，利用免疫共沉淀的IP产物进行分析，以研究病毒基因功能（FeRNAndoMartínez，et.al，2014）。因为植物病毒不能够侵染到动物细胞，同时植物病毒在蛋白以及表达外源肽领域拥有良好的自身特性，所以植物成为相对于普通细胞培育成本更低以及可靠性更强的培育系统。此外，植物生物反应器作为病毒的媒介时拥有很多优势例如：种类丰富，操作简单以及培育风险低等，使得该技术有希望成为现有转基因技术的替代方法（李巧丽，2004）。在病毒表达系统中，新型疫苗的研究受到国内外学者的广泛关注，众多学者都在努力的将不同作物病毒媒介研制成不同类型的外源蛋白表达载体（表2），蛋白多
番木瓜畸形花叶病毒在寄主基因功能鉴定及交叉保护中的应用17图3病毒来源小RNA形成机制（钱李超等，2014）Fig.3TheformationmechanismofVsiRNA（QIANLiChao，et.al，2014）VIGS分子作用机制随着研究的深入被逐步的明确阐述：当前研究表明VIGS的作用机制存在起始阶段、维持阶段以及信号扩增阶段。双链RNA（dsRNA）是诱发基因沉默的主要原因，带有目的基因片段的载体到达细胞后直接转录成单链RNA，再以生成的单链RNA为模版基于RNA聚合酶（RdPR）的作用形成双链RNA（dsRNA），在DICER酶特异性识别作用下将dsRNA分割为21-23bp的短链核苷酸，并被细胞内的解旋酶分解为单链RNA（siRNA），siRNA作为导向RNA会在RdRp的作用下与细胞内的ssRNA配对合成dsRNA，产生全新的dsRNA再一次被DICER酶进一步切割，以此不间断的重复可以放大信号，最后目的基因的mRNA被降解（图3），使目的基因沉默（Purkayastha&Dasgupta，2009）。（3）VIGS病毒载体的研究进展现阶段VIGS载体的实验方法主要是将不同的作物病毒当成VIGS的基础载体以研究作物基因功能。目前研究成果中主要存在三类病毒载体，分别是DNA病毒、RNA病毒以及卫星病毒加工产生的载体，这三类病毒载体自身的特点决定了他们的适用领域。1)由RNA病毒构建的VIGS载体学者Kumagai等最先通过烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）载体对烟草胡萝卜素生成渠道中的一个重要酶PDS进行了沉默，因为类胡萝卜素在植物体内拥有光保护功能，所以侵染作物的叶片变成白色（Kumagai，et.al，1995）。接着
【参考文献】：
期刊论文
[1]芥菜型油菜硫代葡萄糖苷基因的研究进展[J]. 燕孟娇,宋培玲,皇甫海燕,郝丽芬,郭晨,皇甫九茹,贾晓清,吴晶,史志丹,李子钦. 北方农业学报. 2019(01)
[2]植物中病毒诱导基因沉默技术的研究与应用进展[J]. 李姣,于宗霞,冯宝民. 分子植物育种. 2019(05)
[3]VIGS技术的研究进展及其在葫芦科作物中的应用[J]. 刘美,刘莉铭,吴会杰,古勤生. 果树学报. 2018(11)
[4]内含子介导的TBSV病毒表达载体的构建和功能分析[J]. 吴乐乐,徐丽,丁向真,李志英,王盛. 农业生物技术学报. 2018(04)
[5]植物基因功能验证技术概述[J]. 杨诗怡,周小利,陈志芸,顾菁,廖菊够,陈穗云. 安徽农业科学. 2017(34)
[6]应用现代生物技术防治番木瓜RNA病毒研究进展[J]. 赵辉,贺萍萍,郭静远,孔华,郭安平. 分子植物育种. 2017(11)
[7]植物叶色变化机制研究进展[J]. 李卫星,杨舜博,何智冲,金飚. 园艺学报. 2017(09)
[8]一种E.coli-Free的酵母同源重组系统稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的新方法[J]. 庹德财,沈文涛,言普,黎小瑛,周鹏. 热带作物学报. 2017(08)
[9]葫芦科作物重要种传病毒研究进展[J]. 郑棚峻,张宇,张松柏,刘勇,张德咏. 江苏农业科学. 2017(03)
[10]番茄GRAS转录因子家族基因SIGLD1的克隆及VIGS载体构建[J]. 牛义岭,姜秀明,许向阳. 基因组学与应用生物学. 2016(08)
博士论文
[1]百合VIGS体系的建立及LhDTX35基因的克隆和功能研究[D]. 徐华.中国农业科学院 2018
[2]矮牵牛转录因子PhOBF1和PhERF2影响病毒诱导基因沉默效率的机理研究[D]. 孙道阳.西北农林科技大学 2016
[3]用于玉米基因功能研究的黄瓜花叶病毒基因沉默载体的创建[D]. 王蓉.中国农业大学 2016
[4]番木瓜畸形花叶病毒检测鉴定及侵染性克隆构建与应用[D]. 庹德财.海南大学 2015
[5]赤拟谷盗RNAi及dsRNA脱靶效应的研究[D]. 王锦达.南京农业大学 2015
[6]豌豆镁离子螯合酶功能和酶活性调控研究[D]. 罗韬.华中农业大学 2012
[7]植物镁离子螯合酶催化动力学研究[D]. 周帅祥.华中农业大学 2012
[8]除虫菊CDSCCI2基因的克隆、功能分析及遗传转化体系建立[D]. 汤玲.重庆大学 2012
[9]番木瓜苄基硫苷生物合成相关基因克隆与表达分析[D]. 李泽友.海南大学 2011
[10]烟草花叶病毒载体及其在植物中表达外源多肽的研究[D]. 李巧丽.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院） 2004
硕士论文
[1]番木瓜畸形花叶病毒弱毒突变体的筛选及其交叉保护作用[D]. 谭东.海南大学 2018
[2]番木瓜环斑病毒弱毒株交叉保护防治环斑病毒病的研究[D]. 付兰兰.海南大学 2017
[3]弱毒突变体对烟草脉带花叶病毒的交叉保护作用[D]. 许斐斐.山东农业大学 2013
[4]NRG1的分子进化及其在不同烟草物种TMV抗性中的作用[D]. 王敏.华中农业大学 2012
[5]油茶组培体系的建立及VIGS系统在油茶、油桐基因功能研究中的应用[D]. 刘虹.西南大学 2012
[6]P型番木瓜环斑病毒海南分离物（PRSV-P HN-2）全长cDNA侵染性克隆的构建与分析[D]. 庹德财.海南大学 2011
本文编号：3582385
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：135 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
PLDMV基因组序列
海南大学博士学位论文8中（GomordV，et.al，1984）。接下来，外国学者Ahlquist在80年代应用BMV-Russian株系研制了两种载体，将氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因进行表达（Alquist，P，et.al，1986）。现如今，RNA病毒受到广泛关注并取得了很多研究成果，RNA和DNA病毒都能够以表达载体的形式进行更深入的分析（Boyer，RL，et.al，2004）。（1）利用植物病毒表达外源基因的研究进展在研究植物病毒与寄主的互作方面，植物病毒表达载体最广泛地应用是在植物病毒中插入GFP或者其他荧光报告基因，在插入报告基因的植物病毒侵染植株后出现症状时，染病的植株在特定紫外灯光照射下，可以显著的观察到病毒在植物中的累积部位所发出的荧光，可用于研究病毒在寄主中的复制，积累与运动示踪（如图2）。图2UV灯照射下PLDM模式PLDMVV-GFP感病植株与健株对照Fig.2PLMV-GFPplantsandhealthyplantsunderUVLAMP而在病毒基因片段中插入抗体标签则还可以进行免疫共沉淀实验。在FeRNAndoMartínez的研究中，将烟草蚀纹病毒中的P1蛋白插入Strep标签并侵染植物，利用免疫共沉淀的IP产物进行分析，以研究病毒基因功能（FeRNAndoMartínez，et.al，2014）。因为植物病毒不能够侵染到动物细胞，同时植物病毒在蛋白以及表达外源肽领域拥有良好的自身特性，所以植物成为相对于普通细胞培育成本更低以及可靠性更强的培育系统。此外，植物生物反应器作为病毒的媒介时拥有很多优势例如：种类丰富，操作简单以及培育风险低等，使得该技术有希望成为现有转基因技术的替代方法（李巧丽，2004）。在病毒表达系统中，新型疫苗的研究受到国内外学者的广泛关注，众多学者都在努力的将不同作物病毒媒介研制成不同类型的外源蛋白表达载体（表2），蛋白多
番木瓜畸形花叶病毒在寄主基因功能鉴定及交叉保护中的应用17图3病毒来源小RNA形成机制（钱李超等，2014）Fig.3TheformationmechanismofVsiRNA（QIANLiChao，et.al，2014）VIGS分子作用机制随着研究的深入被逐步的明确阐述：当前研究表明VIGS的作用机制存在起始阶段、维持阶段以及信号扩增阶段。双链RNA（dsRNA）是诱发基因沉默的主要原因，带有目的基因片段的载体到达细胞后直接转录成单链RNA，再以生成的单链RNA为模版基于RNA聚合酶（RdPR）的作用形成双链RNA（dsRNA），在DICER酶特异性识别作用下将dsRNA分割为21-23bp的短链核苷酸，并被细胞内的解旋酶分解为单链RNA（siRNA），siRNA作为导向RNA会在RdRp的作用下与细胞内的ssRNA配对合成dsRNA，产生全新的dsRNA再一次被DICER酶进一步切割，以此不间断的重复可以放大信号，最后目的基因的mRNA被降解（图3），使目的基因沉默（Purkayastha&Dasgupta，2009）。（3）VIGS病毒载体的研究进展现阶段VIGS载体的实验方法主要是将不同的作物病毒当成VIGS的基础载体以研究作物基因功能。目前研究成果中主要存在三类病毒载体，分别是DNA病毒、RNA病毒以及卫星病毒加工产生的载体，这三类病毒载体自身的特点决定了他们的适用领域。1)由RNA病毒构建的VIGS载体学者Kumagai等最先通过烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）载体对烟草胡萝卜素生成渠道中的一个重要酶PDS进行了沉默，因为类胡萝卜素在植物体内拥有光保护功能，所以侵染作物的叶片变成白色（Kumagai，et.al，1995）。接着
【参考文献】：
期刊论文
[1]芥菜型油菜硫代葡萄糖苷基因的研究进展[J]. 燕孟娇,宋培玲,皇甫海燕,郝丽芬,郭晨,皇甫九茹,贾晓清,吴晶,史志丹,李子钦. 北方农业学报. 2019(01)
[2]植物中病毒诱导基因沉默技术的研究与应用进展[J]. 李姣,于宗霞,冯宝民. 分子植物育种. 2019(05)
[3]VIGS技术的研究进展及其在葫芦科作物中的应用[J]. 刘美,刘莉铭,吴会杰,古勤生. 果树学报. 2018(11)
[4]内含子介导的TBSV病毒表达载体的构建和功能分析[J]. 吴乐乐,徐丽,丁向真,李志英,王盛. 农业生物技术学报. 2018(04)
[5]植物基因功能验证技术概述[J]. 杨诗怡,周小利,陈志芸,顾菁,廖菊够,陈穗云. 安徽农业科学. 2017(34)
[6]应用现代生物技术防治番木瓜RNA病毒研究进展[J]. 赵辉,贺萍萍,郭静远,孔华,郭安平. 分子植物育种. 2017(11)
[7]植物叶色变化机制研究进展[J]. 李卫星,杨舜博,何智冲,金飚. 园艺学报. 2017(09)
[8]一种E.coli-Free的酵母同源重组系统稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的新方法[J]. 庹德财,沈文涛,言普,黎小瑛,周鹏. 热带作物学报. 2017(08)
[9]葫芦科作物重要种传病毒研究进展[J]. 郑棚峻,张宇,张松柏,刘勇,张德咏. 江苏农业科学. 2017(03)
[10]番茄GRAS转录因子家族基因SIGLD1的克隆及VIGS载体构建[J]. 牛义岭,姜秀明,许向阳. 基因组学与应用生物学. 2016(08)
博士论文
[1]百合VIGS体系的建立及LhDTX35基因的克隆和功能研究[D]. 徐华.中国农业科学院 2018
[2]矮牵牛转录因子PhOBF1和PhERF2影响病毒诱导基因沉默效率的机理研究[D]. 孙道阳.西北农林科技大学 2016
[3]用于玉米基因功能研究的黄瓜花叶病毒基因沉默载体的创建[D]. 王蓉.中国农业大学 2016
[4]番木瓜畸形花叶病毒检测鉴定及侵染性克隆构建与应用[D]. 庹德财.海南大学 2015
[5]赤拟谷盗RNAi及dsRNA脱靶效应的研究[D]. 王锦达.南京农业大学 2015
[6]豌豆镁离子螯合酶功能和酶活性调控研究[D]. 罗韬.华中农业大学 2012
[7]植物镁离子螯合酶催化动力学研究[D]. 周帅祥.华中农业大学 2012
[8]除虫菊CDSCCI2基因的克隆、功能分析及遗传转化体系建立[D]. 汤玲.重庆大学 2012
[9]番木瓜苄基硫苷生物合成相关基因克隆与表达分析[D]. 李泽友.海南大学 2011
[10]烟草花叶病毒载体及其在植物中表达外源多肽的研究[D]. 李巧丽.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院） 2004
硕士论文
[1]番木瓜畸形花叶病毒弱毒突变体的筛选及其交叉保护作用[D]. 谭东.海南大学 2018
[2]番木瓜环斑病毒弱毒株交叉保护防治环斑病毒病的研究[D]. 付兰兰.海南大学 2017
[3]弱毒突变体对烟草脉带花叶病毒的交叉保护作用[D]. 许斐斐.山东农业大学 2013
[4]NRG1的分子进化及其在不同烟草物种TMV抗性中的作用[D]. 王敏.华中农业大学 2012
[5]油茶组培体系的建立及VIGS系统在油茶、油桐基因功能研究中的应用[D]. 刘虹.西南大学 2012
[6]P型番木瓜环斑病毒海南分离物（PRSV-P HN-2）全长cDNA侵染性克隆的构建与分析[D]. 庹德财.海南大学 2011
本文编号：3582385
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