柞蚕核型多角体病毒表达系统表达ApGFAT的研究
发布时间：2022-01-13 12:07
谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶（Glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT）是己糖胺生物合成途径的限速酶,主要位于胞质内,在不同物种间较为保守。己糖胺合成途径作为能量的感受器,可以整合葡萄糖、氨基酸、脂质和核苷酸代谢等代谢途径。己糖胺合成途径的终产物UDP-GlcNAc参与了糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂等物质的合成,在细胞中的生物学意义非常重要。在昆虫中,己糖胺合成途径又是几丁质代谢的组成部分。柞蚕作为我国特有的一种重要绢丝类昆虫,它的生长发育离不开能量代谢和骨骼重塑。柞蚕体壁的外表层和内表层由几丁质与蛋白质组成,柞蚕干蛹中的几丁质质量分数约占2.8%。但是该合成途径还未在柞蚕中发现,GFAT作为该途径的重要节点,对其研究发现有重要意义。磷酸化是调节GFAT活性的重要方式,在人源、小鼠,果蝇等不同物种中均有GFAT磷酸化报道。该蛋白由于活性不稳定,其在真核表达体系中大量表达、纯化一直成为难点。本研究旨在利用柞蚕核型多角体病毒表达体系,表达、纯化出具有活性的柞蚕谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶（ApGFAT）。首先从柞蚕转录组数据...
【文章来源】：大连理工大学辽宁省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
己糖胺生物合成途径Fig.1.3HexosamineBiosyntheticPathway
柞蚕核型多角体病毒表达系统表达ApGFAT的研究-4-首先两个结构域活性口袋开放，Q-环被Arg539*（在不同物种GFAT保守）锚定，Trp74阻断氨通道。(2)Fru-6-P进入糖异构酶活性口袋，C-tail关闭(3)Fru-6-P的糖环打开后，与Lys603形成席夫碱(Schiffbase)。(4)谷氨酰胺进入谷氨酰胺酶后脱氨，氨通道打开，氨进入糖异构酶。(5)氨与开环后的Fru-6-P反应生成GlcNAc-6-P，水分子通过通道进入谷氨酰胺酶，生成谷氨酸盐释放出去。图1.4GlmS催化过程Fig.1.4ThecatalyticcycleofGlmS真核生物与原核物之间的糖异构酶和谷氨酰胺酶结构域活性位点都完全保守，但结构域间连接子在原核生物内显示出高度的异质性，而真核域间连接子有很好地保守性。2009年[16]，首次获得了人源GFAT1的糖异构酶二聚体晶体结构，且人类GFAT1的活性位点与GlmS相似，表明GFAT1的二聚体结构状态是生物学相关状态。GFAT1的糖异构酶结构域由两个拓扑相似的亚结构域控制，每个亚结构域都包括一个由α螺旋围绕的五层平行的β折叠片，构成了α/β/α折叠特征（图1.5）。UDP-GlcNAc结合通过与Gly355，Thr447，Thr458，Gly461的氢键以及焦磷酸盐与Arg343和His463之间的离子相互作用而稳定[17]。
大连理工大学硕士学位论文-5-图1.5hGFAT晶体结构Fig.1.5hGFATcrystalstructure关于GFAT的研究在近年来越发起人们重视，其表达调控受到严格的控制，它的异常将导致胰岛素抵抗[18]、糖尿病血管并发症等相关代谢紊乱疾病以及阿兹海默症和癌症等疾玻GFAT的研究大多数集中在与糖尿病和并发症的关系上。亚裔印度人是Ⅱ型糖尿病的高危人群，研究表明在淋巴细胞中GFAT活性与GFATmRNA水平、糖化血红蛋白水平、胰岛素抵抗、餐后血糖水平和血浆氧化损伤标志物水平呈正相关。动脉粥样硬化是糖尿病的常见并发症。血小板反应蛋白-1（TSP-1）是一种抗血管生成和促动脉粥样硬化蛋白，其转录被HBP激活。GFAT的过表达增加了人主动脉平滑肌细胞TSP-1的mRNA水平[19]。HepG2中GFAT的过量表达增加了内质网应激标志物的表达和炎性途径激活，内质网应激参与糖尿病的动脉粥样硬化的发展。近年来，GFAT与癌症的关系引起了人们的重视，异常的葡萄糖代谢是癌细胞的特征之一。胰腺导管腺癌（PDA）普遍由Kras癌基因的突变引发，突变体Kras通过上调GFAT来驱动葡萄糖通入己糖胺生物合成途径，促进代谢途径来支持癌细胞中的新陈代谢，从而在严峻的肿瘤微环境中支持生存和增殖。GFAT1的高表达与淋巴结转移、pTNM分期和总生存期（OS）呈正相关。研究表明，GFAT1可作为OS的独立预测因子，它的表达水平可预测胰腺癌患者的预后不良[20]。磷酸化是调节GFAT活性的重要方式。早期GFAT被认为受蛋白激酶A（proteinkinaseA，PKA）调控，2007年YanyanLi等[21]通过体外AMP激活的蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）磷酸化修饰的方式鉴定出人源GFAT1蛋白的S243位点。如图所示，5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷（AICAR）或血管内皮生长因子
【参考文献】：
期刊论文
[1]东北柞蚕生产现状及对策[J]. 刘程哲. 现代农业科技. 2020(06)
[2]不同柞蚕品种鲜蛹营养组分检测及分析[J]. 柯皓天,吕银,陈祥平,范小敏,刘玲,程明. 安徽农业科学. 2019(21)
[3]柞蚕分子生物学研究进展[J]. 孙影,姜义仁,秦利. 蚕业科学. 2019(05)
[4]柞蚕蛹滞育和滞育解除过程中海藻糖酶基因表达模式及酶活力分析[J]. 王德意,汝玉涛,王勇,马月月,那爽,孙良振,姜义仁,秦利. 昆虫学报. 2018(07)
[5]海藻糖代谢及其调控昆虫几丁质合成研究进展[J]. 唐斌,张露,熊旭萍,汪慧娟,王世贵. 中国农业科学. 2018(04)
[6]蜕皮激素受体和超气门蛋白基因在柞蚕发育过程及激素诱导后的表达模式[J]. 汝玉涛,王勇,周敬林,王德意,马月月,姜义仁,高清,秦利. 蚕业科学. 2017(04)
[7]松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶基因克隆与表达[J]. 蔡紫玲,吴华俊,林同. 西南农业学报. 2016(09)
[8]Glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase的表达纯化以及结晶[J]. 汤雪. 南开大学学报(自然科学版). 2016(01)
[9]柞蚕滞育问题研究综述[J]. 陈书峰. 吉林农业. 2014(08)
[10]甜菜夜蛾UAP的克隆、时空表达及RNAi研究[J]. 陈洁,陈宏鑫,姚琼,张文庆. 中国农业科学. 2014(07)
硕士论文
[1]GFAT和PFK调控褐飞虱几丁质及能量代谢的差异研究[D]. 邱玲玉.杭州师范大学 2019
[2]飞蝗GFAT和GNA的分子特性及生物学功能研究[D]. 张欢欢.山西大学 2012
本文编号：3586394
【文章来源】：大连理工大学辽宁省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
己糖胺生物合成途径Fig.1.3HexosamineBiosyntheticPathway
柞蚕核型多角体病毒表达系统表达ApGFAT的研究-4-首先两个结构域活性口袋开放，Q-环被Arg539*（在不同物种GFAT保守）锚定，Trp74阻断氨通道。(2)Fru-6-P进入糖异构酶活性口袋，C-tail关闭(3)Fru-6-P的糖环打开后，与Lys603形成席夫碱(Schiffbase)。(4)谷氨酰胺进入谷氨酰胺酶后脱氨，氨通道打开，氨进入糖异构酶。(5)氨与开环后的Fru-6-P反应生成GlcNAc-6-P，水分子通过通道进入谷氨酰胺酶，生成谷氨酸盐释放出去。图1.4GlmS催化过程Fig.1.4ThecatalyticcycleofGlmS真核生物与原核物之间的糖异构酶和谷氨酰胺酶结构域活性位点都完全保守，但结构域间连接子在原核生物内显示出高度的异质性，而真核域间连接子有很好地保守性。2009年[16]，首次获得了人源GFAT1的糖异构酶二聚体晶体结构，且人类GFAT1的活性位点与GlmS相似，表明GFAT1的二聚体结构状态是生物学相关状态。GFAT1的糖异构酶结构域由两个拓扑相似的亚结构域控制，每个亚结构域都包括一个由α螺旋围绕的五层平行的β折叠片，构成了α/β/α折叠特征（图1.5）。UDP-GlcNAc结合通过与Gly355，Thr447，Thr458，Gly461的氢键以及焦磷酸盐与Arg343和His463之间的离子相互作用而稳定[17]。
大连理工大学硕士学位论文-5-图1.5hGFAT晶体结构Fig.1.5hGFATcrystalstructure关于GFAT的研究在近年来越发起人们重视，其表达调控受到严格的控制，它的异常将导致胰岛素抵抗[18]、糖尿病血管并发症等相关代谢紊乱疾病以及阿兹海默症和癌症等疾玻GFAT的研究大多数集中在与糖尿病和并发症的关系上。亚裔印度人是Ⅱ型糖尿病的高危人群，研究表明在淋巴细胞中GFAT活性与GFATmRNA水平、糖化血红蛋白水平、胰岛素抵抗、餐后血糖水平和血浆氧化损伤标志物水平呈正相关。动脉粥样硬化是糖尿病的常见并发症。血小板反应蛋白-1（TSP-1）是一种抗血管生成和促动脉粥样硬化蛋白，其转录被HBP激活。GFAT的过表达增加了人主动脉平滑肌细胞TSP-1的mRNA水平[19]。HepG2中GFAT的过量表达增加了内质网应激标志物的表达和炎性途径激活，内质网应激参与糖尿病的动脉粥样硬化的发展。近年来，GFAT与癌症的关系引起了人们的重视，异常的葡萄糖代谢是癌细胞的特征之一。胰腺导管腺癌（PDA）普遍由Kras癌基因的突变引发，突变体Kras通过上调GFAT来驱动葡萄糖通入己糖胺生物合成途径，促进代谢途径来支持癌细胞中的新陈代谢，从而在严峻的肿瘤微环境中支持生存和增殖。GFAT1的高表达与淋巴结转移、pTNM分期和总生存期（OS）呈正相关。研究表明，GFAT1可作为OS的独立预测因子，它的表达水平可预测胰腺癌患者的预后不良[20]。磷酸化是调节GFAT活性的重要方式。早期GFAT被认为受蛋白激酶A（proteinkinaseA，PKA）调控，2007年YanyanLi等[21]通过体外AMP激活的蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）磷酸化修饰的方式鉴定出人源GFAT1蛋白的S243位点。如图所示，5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷（AICAR）或血管内皮生长因子
【参考文献】：
期刊论文
[1]东北柞蚕生产现状及对策[J]. 刘程哲. 现代农业科技. 2020(06)
[2]不同柞蚕品种鲜蛹营养组分检测及分析[J]. 柯皓天,吕银,陈祥平,范小敏,刘玲,程明. 安徽农业科学. 2019(21)
[3]柞蚕分子生物学研究进展[J]. 孙影,姜义仁,秦利. 蚕业科学. 2019(05)
[4]柞蚕蛹滞育和滞育解除过程中海藻糖酶基因表达模式及酶活力分析[J]. 王德意,汝玉涛,王勇,马月月,那爽,孙良振,姜义仁,秦利. 昆虫学报. 2018(07)
[5]海藻糖代谢及其调控昆虫几丁质合成研究进展[J]. 唐斌,张露,熊旭萍,汪慧娟,王世贵. 中国农业科学. 2018(04)
[6]蜕皮激素受体和超气门蛋白基因在柞蚕发育过程及激素诱导后的表达模式[J]. 汝玉涛,王勇,周敬林,王德意,马月月,姜义仁,高清,秦利. 蚕业科学. 2017(04)
[7]松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶基因克隆与表达[J]. 蔡紫玲,吴华俊,林同. 西南农业学报. 2016(09)
[8]Glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase的表达纯化以及结晶[J]. 汤雪. 南开大学学报(自然科学版). 2016(01)
[9]柞蚕滞育问题研究综述[J]. 陈书峰. 吉林农业. 2014(08)
[10]甜菜夜蛾UAP的克隆、时空表达及RNAi研究[J]. 陈洁,陈宏鑫,姚琼,张文庆. 中国农业科学. 2014(07)
硕士论文
[1]GFAT和PFK调控褐飞虱几丁质及能量代谢的差异研究[D]. 邱玲玉.杭州师范大学 2019
[2]飞蝗GFAT和GNA的分子特性及生物学功能研究[D]. 张欢欢.山西大学 2012
本文编号：3586394
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