家蚕BmSP2应答白僵菌侵染的分子功能研究

发布时间：2022-01-16 08:26

　　家蚕（Bombyx mori）既是一种重要的经济昆虫,也是鳞翅目昆虫的模式生物,在昆虫的生理、病理遗传和免疫等领域具有重要作用。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是对家蚕危害最严重的病原真菌,被感染的家蚕无法结茧或化蛹,从而对蚕业生产与经济造成重大损失。本实验从前期构建的家蚕感染白僵菌的数字基因表达谱中,筛选出差异表达的家蚕性别特异性贮存蛋白基因BmSP2（Bombyx mori sex-specific storage-protein 2,BmSP2）,克隆、表达并研究其对白僵菌的免疫功能。得到的实验结果如下:1.克隆BmSP2的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）并利用原核系统表达BmSP2蛋白,验证BmSP2蛋白对白僵菌的抑制作用。以BmSP2为研究对象,以家蚕p50品种为实验材料,通过RT-PCR方法克隆、获得该基因的开放阅读框序列,该序列有2112个碱基,编码703个氨基酸,其中第1-18个氨基酸为信号肽。将BmSP2目的片段连接到pET-28a表达载体上构建pET-28a-BmSP2载体,在16℃以0.8mM的IPTG成功诱导表达可溶性... 

【文章来源】：江苏科技大学江苏省

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

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英文缩写说明
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 白僵菌对家蚕的危害
    1.2 昆虫贮存蛋白的研究
        1.2.1 贮存蛋白的介绍
        1.2.2 昆虫的免疫应答
        1.2.3 贮存蛋白的免疫作用
    1.3 转座子的发展与应用
        1.3.1 转座子的简单介绍
        1.3.2 PiggyBac转座子的应用和发展
    1.4 研究内容与技术路线
        1.4.1 研究内容
        1.4.2 技术路线
    1.5 本研究的目的和意义
第二章 家蚕贮存蛋白BmSP2的克隆、表达及时空特异性表达
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 材料
        2.1.2 实验仪器与设备
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要培养基的配制
        2.1.5 常用溶液的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 准备家蚕材料
        2.2.2 提取总RNA
        2.2.3 反转录成cDNA
        2.2.4 BmSP2的序列分析
        2.2.5 BmSP2的克隆
        2.2.6 构建重组表达质粒并测序
        2.2.7 构建BmSP2的重组表达质粒pET-28a-BmSP
        2.2.8 表达目的蛋白
        2.2.9 检测并纯化目的蛋白
        2.2.10 测定目的蛋白的浓度
        2.2.11 实时荧光定量PCR
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 BmSP2的克隆
        2.3.2 BmSP2的蛋白表达分析
        2.3.3 BmSP2基因的时空特异性表达分析
    2.4 讨论
第三章 家蚕贮存蛋白BmSP2对白僵菌的抑制作用
    3.1 材料与试剂
        3.1.1 家蚕的饲养与球孢白僵菌的复壮
        3.1.2 主要实验仪器
        3.1.3 主要试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 制备白僵菌孢子悬液
        3.2.2 家蚕感染球孢白僵菌
        3.2.3 提取RNA
        3.2.4 反转录成cDNA
        3.2.5 实时荧光定量PCR
        3.2.6 检测目的蛋白对白僵菌的抑制作用
    3.3 结果与分析
        3.3.1 球孢白僵菌感染家蚕的结果
        3.3.2 BmSP2在感染白僵菌的家蚕中的表达特征分析
        3.3.3 BmSP2对白僵菌的抑制作用分析
    3.4 讨论
第四章 构建转基因家蚕验证BmSP2对白僵菌的抑制作用
    4.1 材料与试剂
        4.1.1 试验材料
        4.1.2 主要实验仪器
        4.1.3 主要试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 制备白僵菌孢子悬液
        4.2.2 设计过表达载体
        4.2.3 扩增过表达载体中的片段
        4.2.4 构建含有BmSP2片段的过表达载体
        4.2.5 质粒抽提与纯化
        4.2.6 家蚕卵的显微注射
    4.3 结果与分析
        4.3.1 构建完成的过表达质粒及图谱
        4.3.2 转基因BmSP2过表达个体与白僵菌的互作试验
    4.4 讨论
结论
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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[9]piggyBac转座子及其转基因昆虫的应用[J]. 唐丽莉,陈斌,何正波,李廷景.  安徽农业科学. 2010(06)
[10]球孢白僵菌的研究应用与展望[J]. 余素红,曾明森,吴光远.  茶叶科学技术. 2009(03)

博士论文
[1]家蚕免疫系统相关基因的鉴定及其诱导表达模式研究[D]. 程廷才.西南大学 2008
[2]piggyBac转座系统[D]. 丁昇.复旦大学 2007

硕士论文
[1]家蚕储存蛋白Storage protein（SP3）基因克隆及调节黑化作用的研究[D]. 何渐鸣.苏州大学 2014



本文编号：3592290