大豆miR1510和GmWRKY40在抗疫霉根腐病中的功能与机制研究

发布时间：2022-01-17 04:31

　　大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌引起的严重危害大豆生产的毁灭性病害之一。近年来,大豆疫霉根腐病在我国大豆主产区呈逐渐扩大蔓延的趋势,并造成重大的经济损失。合理利用抗、耐病品种是防治该病最经济有效的途径,然而大豆疫霉生理小种进化速度快、毒力结构趋于复杂化,常规育种工作周期长,抗性资源有限,很难满足生产的需要。因此,研究大豆与疫霉互作的分子机理则是解释病害发生机制,解决该问题的根本途径之一。植物在发育过程中为了抵御病原物的侵染,逐渐形成并完善了一系列复杂有效的保护机制和防御网络。植物miRNA通过指导靶基因的转录后调控,在植物防卫反应中起着重要作用。gma-miRl510是本实验室前期利用生物芯片技术鉴定的一个参与大豆响应疫霉菌侵染的miRNA,其预测靶基因能够编码NB-LRR型抗病蛋白,本研究通过5’-RACE方法鉴定其靶标基因,并将gma-miR1510在大豆发状根组织中过表达,研究其在大豆一大豆疫霉互作过程中的功能。WRKY转录因子作为植物中最大的转录调节因子家族之一,是调节植物生理过程信号网络的重要组成成分,本研究通过RNA干扰的方法,将GmWRKY40基因进行沉默,研究其在大豆响应疫... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：129 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图２－１?ｇｍａ－ｍｉＲｌ?５１０在大豆中的表达模式??Ｆｉｇ．?２－１?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐｒｏｆｉｌｅｓ?ｏｆ?ｇｍａ－ｍｉＲ１５１０?ｉｎ?ｓｏｙｂｅａｎ．??

离得到ｍＲＮＡ，然后在ｍＲＮＡ的５’端连接ＲＮＡ接头，将其反转录成ｃＤＮＡ，最后利??用Ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ?５’－ＲＡＣＥ?ｐｒｉｍｅｒ扩增预测长度的革Ｅ基因，得到与预测大小一致的阳性??克隆对其进行测序分析。如图２－２所示，结果显示基因的断裂位点??与预测的一致，该基因编码典型的ＴＩＲ和ＮＢ－ＬＲＲ植物抗病结构域，说明ｇｍａ－ｍｉＲｌ?５丨０??很可能通过直接调控ＮＢ结构域抗病基因来参与大豆对疫霉的抗性。??ｒ?＿＿＿?

通过酶切、连接的方法插入到植物双元表达载体ＰＣＡＭＢＩＡ２３０１中，构建了?ｍｉＲ１５１０ａ／ｂ??过表达载体。通过发根农杆菌Ｋ５９９介导的大豆子叶遗传转化将其转化大豆，诱导产??生发状根（图２－５，Ａ）。首先，利用ｐＣＡＭＢ丨Ａ２３０１载体上的ＧＵＳ报告基因，通过??ＧＵＳ组织化学染色的方法对发状根进行初步筛选，转基因的阳性根可以显蓝色（图??２－５，?Ｂ）；其次，在ａｔｈ－ｍｉＲ３１９ａ的前体骨架序列中以及ＧＵＳ基因序列中分别设计一－??对引物，利用半定量ＲＴ－ＰＣＲ在ＤＮＡ水平进行分子验证（图２－５，?Ｃ）；最后利用ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ??ｑＲＴ－ＰＣＲ检测ｍｉＲＩ５ＩＯａ／ｂ成熟体的表达丰度，如图２－５，?Ｄ所示，与转空载体的对照??相比，转基因发状根中ｍｉＲＩ５ｌ（）ａ和ｍｉＲ１５１０ｔ）的表达量分别是对照的５倍和２倍，??说明拟南芥ｍｉＲ３ｌ９ａ的前体骨架可以成功地用于过表达ｍｉＲＩ５１０，我们获得的转基因??发状根用于进一步的功能研宄。我们进一步分析靶基因扣在过表达??ｍｉＲＩ５ＩＯａ／ｂ的发状根中的表达情况，结果发现，ｍｉＲ１５１０ａ／ｂ的过表达明显抑制??㈨的转录水平（图２－５


本文编号：3594047