小麦条锈菌效应蛋白Pst19032功能分析及互作靶标鉴定
发布时间：2022-02-08 12:56
由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f.sp.tritici）引致的小麦条锈病对我国和全球小麦种植造成严重危害。由于缺乏可靠的遗传转化技术,目前对小麦条锈菌的重要基因及致病机理尚不清楚。效应蛋白,一类由病原菌分泌的、干扰或损害寄主植物生理代谢和防卫反应、增加寄主易感性从而助于侵染的小分子蛋白,在病原菌的致病过程中发挥非常重要的作用。而根据“基因对基因假说”,当植物体内存在能识别这些蛋白的R基因时,R蛋白与这些效应蛋白发生互作,向下游传递抗病信号引发更为激烈的免疫反应,这些被识别的效应蛋白发挥无毒性功能。因而,分析效应蛋白的功能、找到与它发生互作的关键标靶蛋白,可进一步明确效应蛋白的具体作用,揭示小麦条锈菌的致病机制与寄主的防御机理。为此,本论文在前期实验的基础上选取了含有核定位信号的Pst19032效应蛋白进行了深入研究,主要研究结果如下:（1）通过分析该基因的种间和种内多态性,发现该基因非常保守;（2）实时荧光定量分析发现,Pst19032在侵染的中期和后期出现两个表达高峰,推测其功能具有多样性;（3）通过构建荧光载体进行小麦原生质体转化的研究发现,该效...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
植物与病菌互作中植物免疫系统的“Z”字模型（JonesandDangl,2006）
4小麦条锈菌效应蛋白Pst19032功能分析及互作靶标鉴定图1-1植物与病菌互作中植物免疫系统的“Z”字模型（JonesandDangl,2006）Figure1-1."Zigzag"modeloftheplantimmunesystemintheinteractionbetweenplantsandpathogens1.2.2特异结构：吸器锈菌作为活体寄生型的病原物，在侵染过程中其营养物质都来自于寄主植物细胞。在侵染期间，真菌菌丝在叶片的细胞间隙生长，通过吸器这一特异结构与宿主形成密切联系。吸器在破坏寄主细胞壁后，将进一步在植物细胞质膜中扩张，并构成独特的寄主—病原体界面。吸器是锈菌从植物中获取营养物质的主要方式（VoegeleandMendgen,2003），是病原菌抵抗植物识别的重要场所，同时很多寄主免疫响应也在此开始（Heathetal.1997;HahnandMendgen,2001）。在这里发生的动态相互作用包括营养物质运输，信号传导和防御反应等。吸器作为锈菌与寄主植物之间的交流场所，有很多蛋白质集中在这个区域发挥作用。现有的研究证明锈菌病原物分泌的效应蛋白大多数通过吸器进入寄主细胞，以促进感玻图1-2效应蛋白在吸器处表达（Koecketal.2011）Figure1-2.Schematicdiagramoftheexpressionoftheeffectorproteins
第二章材料与方法19液10mL，充分重悬细胞后再次离心；重复前一步骤一次，弃上清后再用5mL的10mMMgCl2溶液重悬细胞，测OD。此外，含BAX的农杆菌抗性为庆大；测OD后用10mMMgCl2溶液将实验组与对照组的浓度都稀释到0.3，黑暗静置2h后可用。2.2.4.2注射侵染用1mL注射器进行注射。操作时先用针头在烟草叶片上轻轻刺孔注意不要穿透叶片，之后推动活塞吸取菌液并接触叶片进行注射晕染。在农杆菌介导的抑制BAX引起的坏死实验中尽量将侵染范围控制成圆斑形状，记好各侵染斑的位置与对应的基因，在盆壁上进行相应标记。1d后，在同一圆斑注射含BAX的农杆菌菌液，一周后进行坏死观察。分布情况：图2-1基因分布图Figure2-1.Thedistributionofgenes2.2.5利用荧光假单胞Ⅲ型分泌系统验证效应蛋白功能2.2.5.1pEDV6载体的构建在本实验中，将克隆得到的Pst19032构建到pEDV6载体，提质粒、酶切与检测步骤同2.2.3.1中所述。连接反应，由于pED6含有Gateway元件，故用gateway方法进行载体构建，具体分为BP、LR反应两步，注意的是终载pEDV6的抗性为庆大霉素。Gateway方法构建载体BP反应体系（10μL）attB-PCR产物1~7μL（15~150ng）PDONR载体（150ng/μL）1.0μLBPClonaseTMIIenzymemix2.0μLTEBuffer（PH8.0）upto10μL加样后瞬离混匀，25℃，1h以上（过夜更好），取出后加入1μL的蛋白酶K，37℃，10min终止反应。将BP质粒转入大肠杆菌Top10中，提质粒得到Entryclone，进行LR反应得到终载。
【参考文献】：
期刊论文
[1]小麦抗病相关基因聚合育种的研究进展[J]. 赵霞,王长彪,赵兴华,刘江,崔婷,任永康,牛瑜琦,唐朝晖. 山西农业科学. 2017(02)
[2]中国小麦条锈菌当前主要流行小种毒性分析[J]. 袁凤平,魏国荣,詹刚明,姚石,陈伟,曾庆东,黄丽丽,康振生,韩德俊. 麦类作物学报. 2014(11)
[3]Effect of stripe rust on the yield response of wheat to nitrogen[J]. Rakhesh Devadas,Steven Simpfendorfer,David Backhouse,David W.Lamb. The Crop Journal. 2014(04)
[4]诱导烟草早花的PVX-FT系统的建立[J]. 高玉龙,肖炳光,Ralph E Dewey. 中国烟草学报. 2013(06)
[5]利用农杆菌侵染新技术在豌豆中瞬时表达ha FGF[J]. 杨丽萍,金太成,周晓馥. 生物技术通报. 2013(10)
[6]中国小麦条锈病综合治理理论与实践[J]. 陈万权,康振生,马占鸿,徐世昌,金社林,姜玉英. 中国农业科学. 2013(20)
[7]铜绿假单胞菌pfm基因对三型分泌系统效应蛋白的影响[J]. 牟锐,杜星,王雪涵,徐海津,张秀明,白艳玲,乔明强. 微生物学通报. 2013(08)
[8]寄主诱导的基因沉默（HIGS）技术研究进展[J]. 张河山,胡亚亚,张娜,魏学军,杨文香,刘大群. 农业生物技术学报. 2013(05)
[9]我国小麦条锈菌体细胞遗传重组的分子证据[J]. 陆宁海,詹刚明,王建锋,黄丽丽,康振生. 植物病理学报. 2009(06)
[10]中国小麦条锈菌主要流行菌系的寄生适合度研究[J]. 王保通,李高宝,李强,王芳,史亚千,刘倩如,康振生. 植物病理学报. 2009(01)
博士论文
[1]条锈菌与小麦互作中效应蛋白及诱导寄主细胞坏死基因的鉴定与功能分析[D]. 汤春蕾.西北农林科技大学 2013
[2]小麦与条锈菌互作机理研究及抗条锈相关基因的功能分析[D]. 王晓杰.西北农林科技大学 2009
本文编号：3615104
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
植物与病菌互作中植物免疫系统的“Z”字模型（JonesandDangl,2006）
4小麦条锈菌效应蛋白Pst19032功能分析及互作靶标鉴定图1-1植物与病菌互作中植物免疫系统的“Z”字模型（JonesandDangl,2006）Figure1-1."Zigzag"modeloftheplantimmunesystemintheinteractionbetweenplantsandpathogens1.2.2特异结构：吸器锈菌作为活体寄生型的病原物，在侵染过程中其营养物质都来自于寄主植物细胞。在侵染期间，真菌菌丝在叶片的细胞间隙生长，通过吸器这一特异结构与宿主形成密切联系。吸器在破坏寄主细胞壁后，将进一步在植物细胞质膜中扩张，并构成独特的寄主—病原体界面。吸器是锈菌从植物中获取营养物质的主要方式（VoegeleandMendgen,2003），是病原菌抵抗植物识别的重要场所，同时很多寄主免疫响应也在此开始（Heathetal.1997;HahnandMendgen,2001）。在这里发生的动态相互作用包括营养物质运输，信号传导和防御反应等。吸器作为锈菌与寄主植物之间的交流场所，有很多蛋白质集中在这个区域发挥作用。现有的研究证明锈菌病原物分泌的效应蛋白大多数通过吸器进入寄主细胞，以促进感玻图1-2效应蛋白在吸器处表达（Koecketal.2011）Figure1-2.Schematicdiagramoftheexpressionoftheeffectorproteins
第二章材料与方法19液10mL，充分重悬细胞后再次离心；重复前一步骤一次，弃上清后再用5mL的10mMMgCl2溶液重悬细胞，测OD。此外，含BAX的农杆菌抗性为庆大；测OD后用10mMMgCl2溶液将实验组与对照组的浓度都稀释到0.3，黑暗静置2h后可用。2.2.4.2注射侵染用1mL注射器进行注射。操作时先用针头在烟草叶片上轻轻刺孔注意不要穿透叶片，之后推动活塞吸取菌液并接触叶片进行注射晕染。在农杆菌介导的抑制BAX引起的坏死实验中尽量将侵染范围控制成圆斑形状，记好各侵染斑的位置与对应的基因，在盆壁上进行相应标记。1d后，在同一圆斑注射含BAX的农杆菌菌液，一周后进行坏死观察。分布情况：图2-1基因分布图Figure2-1.Thedistributionofgenes2.2.5利用荧光假单胞Ⅲ型分泌系统验证效应蛋白功能2.2.5.1pEDV6载体的构建在本实验中，将克隆得到的Pst19032构建到pEDV6载体，提质粒、酶切与检测步骤同2.2.3.1中所述。连接反应，由于pED6含有Gateway元件，故用gateway方法进行载体构建，具体分为BP、LR反应两步，注意的是终载pEDV6的抗性为庆大霉素。Gateway方法构建载体BP反应体系（10μL）attB-PCR产物1~7μL（15~150ng）PDONR载体（150ng/μL）1.0μLBPClonaseTMIIenzymemix2.0μLTEBuffer（PH8.0）upto10μL加样后瞬离混匀，25℃，1h以上（过夜更好），取出后加入1μL的蛋白酶K，37℃，10min终止反应。将BP质粒转入大肠杆菌Top10中，提质粒得到Entryclone，进行LR反应得到终载。
【参考文献】：
期刊论文
[1]小麦抗病相关基因聚合育种的研究进展[J]. 赵霞,王长彪,赵兴华,刘江,崔婷,任永康,牛瑜琦,唐朝晖. 山西农业科学. 2017(02)
[2]中国小麦条锈菌当前主要流行小种毒性分析[J]. 袁凤平,魏国荣,詹刚明,姚石,陈伟,曾庆东,黄丽丽,康振生,韩德俊. 麦类作物学报. 2014(11)
[3]Effect of stripe rust on the yield response of wheat to nitrogen[J]. Rakhesh Devadas,Steven Simpfendorfer,David Backhouse,David W.Lamb. The Crop Journal. 2014(04)
[4]诱导烟草早花的PVX-FT系统的建立[J]. 高玉龙,肖炳光,Ralph E Dewey. 中国烟草学报. 2013(06)
[5]利用农杆菌侵染新技术在豌豆中瞬时表达ha FGF[J]. 杨丽萍,金太成,周晓馥. 生物技术通报. 2013(10)
[6]中国小麦条锈病综合治理理论与实践[J]. 陈万权,康振生,马占鸿,徐世昌,金社林,姜玉英. 中国农业科学. 2013(20)
[7]铜绿假单胞菌pfm基因对三型分泌系统效应蛋白的影响[J]. 牟锐,杜星,王雪涵,徐海津,张秀明,白艳玲,乔明强. 微生物学通报. 2013(08)
[8]寄主诱导的基因沉默（HIGS）技术研究进展[J]. 张河山,胡亚亚,张娜,魏学军,杨文香,刘大群. 农业生物技术学报. 2013(05)
[9]我国小麦条锈菌体细胞遗传重组的分子证据[J]. 陆宁海,詹刚明,王建锋,黄丽丽,康振生. 植物病理学报. 2009(06)
[10]中国小麦条锈菌主要流行菌系的寄生适合度研究[J]. 王保通,李高宝,李强,王芳,史亚千,刘倩如,康振生. 植物病理学报. 2009(01)
博士论文
[1]条锈菌与小麦互作中效应蛋白及诱导寄主细胞坏死基因的鉴定与功能分析[D]. 汤春蕾.西北农林科技大学 2013
[2]小麦与条锈菌互作机理研究及抗条锈相关基因的功能分析[D]. 王晓杰.西北农林科技大学 2009
本文编号：3615104
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