枯草芽孢杆菌BSD-2全基因组数据挖掘及抗菌物质的分离

发布时间：2022-02-17 14:03

　　枯草芽孢杆菌是一种重要的植物抗病促生微生物,它的抗病机制主要是通过分泌各种抗菌物质完成,羊毛硫细菌素是其中重要的一种抗菌肽。本实验室前期筛选到一株枯草芽孢杆菌BSD-2,其能够产生抑制灰葡萄孢菌、棉枯萎镰刀菌等病原菌的抗菌物质。本文以BSD-2为研究对象,挖掘了BSD-2中潜在的新型抗菌肽合成基因,分析了挖掘到的潜在新型抗菌肽合成酶的结构和功能,对该合成酶的基因功能进行了验证,并对BSD-2产生的抗菌活性物质进行了分离纯化等方面的研究。1.以BSD-2全基因组为研究对象,利用antiSMASH、BAGEL 3和本地Blast等软件挖掘到BSD-2中存在Subtilosin A、Surfactin、Bacilysin和TasA合成基因簇及其完整的合成通路;另挖掘到BSD-2中存在Fengycin、Bacillaene和Bacillibactin合成基因簇,但其合成通路不完整;预测到BSD-2中存在六个潜在的新型第四类羊毛硫细菌素（Class IV Lanthipeptide）的前体肽合成基因,且其合成基因簇及合成通路较完整。2.利用ProtParam、KinasePhos、VMD等软件对... 

【文章来源】：河北工业大学天津市211工程院校

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 枯草芽孢杆菌产生的抗菌肽
        1.1.1 枯草芽孢杆菌的生防价值
        1.1.2 非核糖体途径合成的抗菌肽
        1.1.3 核糖体途径合成的抗菌肽
    1.2 羊毛硫细菌素的生物合成
        1.2.1 羊毛硫细菌素合成基因
        1.2.2 羊毛硫细菌素的生物合成
    1.3 基因组数据挖掘(Genome mining)
        1.3.1 次级代谢产物注释工具antiSMASH
        1.3.2 细菌素和RiPPPs挖掘工具BAGEL3
    1.4 研究内容及意义
第二章 BSD-2基因组数据挖掘
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 数据库
        2.2.2 分析软件
    2.3 方法
        2.3.1 基因数据的来源
        2.3.2 次级代谢产物合成基因簇挖掘
        2.3.3 细菌素编码基因和RiPPPs挖掘
        2.3.4 部分抗菌物质的挖掘
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 BSD-2全基因组的获取
        2.4.2 次级代谢产物合成基因簇挖掘
        2.4.3 BAGEL分析结果
        2.4.4 本地Blast分析结果
    2.5 小结
第三章 新型潜在第四类羊毛硫细菌素合成酶分析
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 数据库
        3.2.2 分析软件
    3.3 方法
        3.3.1 潜在第四类羊毛硫细菌素合成酶序列的获取与确定
        3.3.2 潜在第四类羊毛硫细菌素合成酶的理化性质分析
        3.3.3 激酶磷酸化修饰为点预测
        3.3.4 二级结构及结构域预测
        3.3.5 进化树的建立
        3.3.6 蛋白质三级结构预测
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 潜在第四类羊毛硫细菌素合成酶序列的获取与确定
        3.4.2 第四类羊毛硫肽合成酶的理化性质
        3.4.3 第四类羊毛硫肽合成酶的分子进化分析
        3.4.4 激酶磷酸化修饰为点预测
        3.4.5 二级结构及结构域预测
        3.4.6 蛋白质三级结构预测
    3.5 小结
第四章 新型潜在第四类羊毛硫细菌素合成酶基因敲除
    4.1 引言
    4.2 材料
        4.2.1 菌株和质粒
        4.2.2 主要试剂
        4.2.3 主要的仪器设备
        4.2.4 培养基
    4.3 方法
        4.3.1 枯草芽胞杆菌BSD-2发酵液的制备
        4.3.2 BSD-2基因组DNA的提取
        4.3.3 第四类羊毛硫肽合成酶基因的扩增
        4.3.4 PCR产物回收
        4.3.5 克隆载体的构建
        4.3.6 敲除载体的构建
        4.3.7 带有同源臂的Kana抗性基因的扩增
        4.3.8 重组质粒的构建
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 新型潜在的第四类羊毛硫细菌素合成酶基因的扩增
        4.4.2 克隆载体的构建
        4.4.3 敲除载体的构建
        4.4.4 带有同源臂的kana抗性基因的扩增
        4.4.5 重组质粒的构建
    4.5 小结
第五章 枯草芽孢杆菌BSD-2抗菌肽的分离纯化
    5.1 引言
    5.2 材料
        5.2.1 试剂
        5.2.2 主要仪器
        5.2.3 供试菌株
        5.2.4 培养基
    5.3 方法
        5.3.1 无菌发酵液的制备
        5.3.2 抗菌物质的粗提
        5.3.3 弱阴离子交换层析分离纯化抗菌物质
        5.3.4 HPLC分离纯化抗菌物质
        5.3.5 SDS-PAGE分析
        5.3.6 SDS-PAGE凝胶原位检测抗菌蛋白活性
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 抗菌物质的粗提
        5.4.2 抗菌物质的精提
        5.4.4 HPLC分离纯化抗菌物质
    5.5 小结
第六章 结论
参考文献
攻读学位期间所取得的相关科研成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]抗生素耐药性研究领域的机遇和挑战[J]. 张天宇,谢建平,王明贵.  遗传. 2016(10)
[2]羊毛硫肽类化合物（Lanthipeptide）生物合成新进展[J]. 莫天录,薛林贵,张琪.  微生物学报. 2016(03)
[3]部分模式真菌中Prp5蛋白生物信息学分析[J]. 赵东磊,李金玉,方淑梅,韦江司,王伟,梁喜龙.  微生物学通报. 2015(08)
[4]羊毛硫细菌素生物合成基因簇的遗传分析[J]. 钟瑾,刘刚,还连栋.  中国抗生素杂志. 2006(09)
[5]SDS-PAGE凝胶原位检测抗菌蛋白的活性——生物自显影技术[J]. 邓小娟,曹阳,钟仰进,黄自然.  西南农业大学学报(自然科学版). 2005(01)

硕士论文
[1]细菌界次级代谢产物生物合成基因簇的基因组学注释和比较研究[D]. 孙天拥.山东大学 2016



本文编号：3629532