欧美杨细菌性溃疡病菌双组分系统的鉴定、突变及KdpD-KdpE致病性功能解析

发布时间：2022-02-22 18:32

　　由Lonsdalea quercina subsp.populi引起的欧美杨细菌性溃疡病在国内欧美杨主要种植区河南、山东大面积发生,该病害在天津也有分布,是国内近年来发现的一种新的杨树细菌性病害且有发病面积逐年扩大,危害程度加深的趋势。然而,对该病原菌的致病机理及成灾机制研究较少。在细菌的生长发育、逆境胁迫应答以及寄主-病原互作过程中,双组分信号转导系统是最重要的分子调控机制之一,被誉为细菌的“智商”。为了研究L.quercina subsp.populi双组分信号系统对致病性的调控机制,并了解病原菌与寄主互作的关系,本论文通过生物信息学分析鉴定和序列比对L.quercina subsp.populi N-5-1基因组中的双组分信号转导系统;其次,通过系统地构建插入失活突变体与筛选分析致病性表型,选择其中对病原菌的生长速度、游动性和毒性有明显影响的基因,构建缺失突变体和互补菌株;然后,寻找靶标RR调控的下游基因,并对筛选的下游调控基因进行上位分析,解析其调控致病性的分子机制。研究结果如下:（1）利用已测定的病原细菌菌株N-5-1的基因组序列,通过生物信息学分析,以及识别与HK和RR磷酸... 

【文章来源】：北京林业大学北京市211工程院校教育部直属院校

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 文献综述
    1.1 欧美杨细菌性溃疡病病菌
        1.1.1 欧美杨细菌性溃疡病病原菌基本特性和病害症状
        1.1.2 欧美杨细菌性溃疡病发病规律及防治
        1.1.3 欧美杨细菌性溃疡病菌致病基因研究进展
    1.2 双组分信号转导系统
        1.2.1 组氨酸激酶的结构和功能
        1.2.2 反应调节蛋白的结构和功能
        1.2.3 杂合组氨酸激酶的结构和功能
        1.2.4 细菌中TCSTS的研究进展
    1.3 研究的目的及意义
2 Lonsdelea N-5-1 HK和RR插入失活突变体库的构建
    2.1 材料与方法
        2.1.1 菌种及质粒
        2.1.2 生化试剂
        2.1.3 培养基
        2.1.4 细菌遗传学基本操作
        2.1.5 总DNA的提取
        2.1.6 大肠杆菌电击感受态细胞的制备
        2.1.7 大肠杆菌的电击转化
        2.1.8 两亲接合方法
        2.1.9 插入失活突变体的构建
        2.1.10 细菌游动性检测
        2.1.11 生物检测细菌致病性
    2.2 结果与分析
        2.2.1 Lonsdelea N-5-1基因组编码42个HK和RR蛋白
        2.2.2 插入失活载体的构建
        2.2.3 插入失活突变体库的构建
        2.2.4 插入失活突变体库的表型检测
    2.3 小结与讨论
3 kdpD-kdpE的遗传学分析及KdpD-KdpE构成TCSTS
    3.1 材料与方法
        3.1.1 菌种及质粒
        3.1.2 生化试剂
        3.1.3 培养基
        3.1.4 细菌细胞总RNA的提取
        3.1.5 消化RNA中的DNA
        3.1.6 反转录
        3.1.7 读码框内删除(缺失)突变体的构建
        3.1.8 互补菌株(过表达菌株)的构建
        3.1.9 互补菌株(过表达菌株)的电击转化
        3.1.10 突变体菌株电击感受态细胞的制备
        3.1.11 耐金属离子胁迫、盐胁迫和渗透胁迫检测
        3.1.12 透射电镜观察细菌鞭毛
        3.1.13 抑菌活性检测
        3.1.14 蛋白表达载体的构建
        3.1.15 点突变蛋白表达载体的构建
        3.1.16 可溶性蛋白(His6标签)的表达和纯化
        3.1.17 可溶性蛋白(MBP标签)的表达和纯化
        3.1.18 提取膜蛋白(inverted membrane vesicles,IMV)
        3.1.19 Western blot
        3.1.20 蛋白的磷酸化检测
        3.1.21 微量热泳动实验(MST)
    3.2 结果与分析
        3.2.1 Lqp0375-Lqp0376操纵子结构解析
        3.2.2 Lqp0375-Lqp0376蛋白二级结构
        3.2.3 kdpD-kdpE读码框内删除突变体和互补菌株的构建
        3.2.4 kdpD-kdpE缺失对毒性的影响
        3.2.5 kdpD-kdpE缺失对游动性的影响
        3.2.6 kdpD-kdpE缺失对氧化胁迫和抗性胁迫的影响
        3.2.7 KdpD和KdpE蛋白及其点突变KdpD~(H682A)和KpE~(D53A)蛋白的表达纯化
        3.2.8 KdpD是一个具有激酶活性的组氨酸激酶
        3.2.9 KdpD特异性结合KdpE
    3.3 小结与讨论
4 KdpE调控机理解析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 菌种及质粒
        4.1.2 生化试剂
        4.1.3 培养基
        4.1.4 染色质免疫共沉淀实验(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)
        4.1.5 实时荧光定量PCR
        4.1.6 凝胶阻滞实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)
    4.2 结果与分析
        4.2.1 KdpE调节子的ChIP-seq分析
        4.2.2 EMSA分析表明KdpE直接结合3个靶基因的启动子区
        4.2.3 KdpE正调控3个靶基因的表达
        4.2.4 遗传上位分析kdpE与3个靶基因的关系
    4.3 小结与讨论
5 结论与讨论
参考文献
附表
个人简介
导师简介(一)
导师简介(二)
导师简介(三)
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]欧美杨细菌性溃疡病菌hrcJ基因的功能分析[J]. 李宾,李爱宁,魏强,王海明,贺伟.  林业科学. 2015(12)
[2]欧美杨溃疡病防治的初步研究[J]. 徐方媛,贺伟,常聚普,郭利民,谢守江,杨玉巧.  中国农学通报. 2013(16)
[3]欧美杨溃疡病的病原鉴定[J]. 贺伟,任飞娟,郭利民,李永,常聚普.  林业科学. 2009(06)
[4]濮阳市发现杨树新病害[J]. 郭利民,张鸣放,王洪轩.  河南林业科技. 2008(03)

博士论文
[1]欧美杨细菌性溃疡病菌侵染循环及病害流行研究[D]. 商靖.北京林业大学 2014

硕士论文
[1]欧美杨细菌性溃疡病发生影响因素分析[D]. 倪琳.北京林业大学 2014
[2]欧美杨溃疡病病原鉴定[D]. 任飞娟.北京林业大学 2011



本文编号：3640002