中国小麦花叶病毒侵染性克隆构建及其与宿主HSP70互作研究

发布时间：2022-04-23 13:31

　　上个世纪末,本实验室在我国山东冬小麦上鉴定了一种由禾谷多粘菌传播的新病毒,命名为中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus,CWMV）,它能引起小麦花叶病,导致小麦（Triticumaestivum）严重减产。尽管目前在CWMV的生物学和分子生物学有了明显的进展,但在其反向遗传学及其与宿主相互作用等领域尚存在大量的研究空白。热休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）是生物体内高度保守的一种分子伴侣蛋白,在多种细胞过程中发挥重要作用,也是参与多种病毒侵染过程的重要因子。因此,本研究首先围绕CWMVcDNA克隆构建及其侵染活性进行了探索,然后基于CWMV侵染性克隆分析了 CWMV与宿主HSP70的互作关系,并取得了以下结果:首先,构建了 T7启动子控制下的CWMV全长cDNA克隆,经体外转录、摩擦接种小麦后通过Northern blot、Western blot、电镜观察、症状等实验,分析了该克隆的侵染活性。在此基础上,又构建了 35S启动子控制下的CWMV全长cDNA克隆双元载体,并采用农杆菌浸润法接种本氏烟,实验分析表明该克隆能... 

【文章页数】：119 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第1章 文献综述
    1.1 中国小麦花叶病毒(CWMV)的研究概况
        1.1.1 CWMV田间症状
        1.1.2 CWMV基因组结构
        1.1.3 CWMV编码的蛋白
            1.1.3.1 病毒复制酶(Viral Replicase)
            1.1.3.2 运动蛋白(MP)
            1.1.3.3 外壳蛋白及其相关蛋白
            1.1.3.4 富含半胱氨酸蛋白(CRP)
        1.1.4 CWMV sRNA
    1.2 热休克蛋白HSP70研究概况
        1.2.1 HSP70结构
        1.2.2 HSP70的功能
        1.2.3 HSP70与病毒侵染
            1.2.3.1 HSP70对病毒复制的影响
            1.2.3.2 HSP70对病毒运动的影响
    1.3 本文研究的目的与意义
第2章 实验材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 主要试剂、培养基、仪器等
    2.2 实验的方法
        2.2.1 目的基因的克隆
            2.2.1.1 基因PCR扩增
            2.2.1.2 PCR产物检测与回收纯化
        2.2.2 构建载体
            2.2.2.1 将目的片段连接克隆载体
            2.2.2.2 质粒或者连接产物转化大肠杆菌
            2.2.2.3 鉴定阳性克隆、测序
            2.2.2.4 提取大肠杆菌的质粒
            2.2.2.5 将载体进行双酶切
        2.2.3 重组质粒转化至酵母菌株中
        2.2.4 体外转录产物接种
        2.2.5 农杆菌感受态细胞的制备
        2.2.6 将重组质粒转化至农杆菌感受态细胞中
        2.2.7 农杆菌浸润接种
        2.2.8 Quercetin处理
        2.2.9 荧光观察
        2.2.10 Western blot
        2.2.11 提取Total RNA
        2.2.12 Northern blot
        2.2.13 病毒粒子提取
        2.2.14 电镜观察
        2.2.15 体外转录反应
        2.2.16 诱导目的蛋白原核表达
        2.2.17 荧光定量PCR
        2.2.18 植物细胞质、细胞核提取
        2.2.19 细胞膜蛋白提取
第3章 中国小麦花叶病毒(CWMV)全长侵染性克隆的构建
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 方法
            3.2.2.1 引物设计
            3.2.2.2 病毒分离和病毒粒子的提取
            3.2.2.3 目的基因的扩增及纯化
            3.2.2.4 重组载体的构建
            3.2.2.5 体外转录反应
            3.2.2.6 体外转录产物接种
            3.2.2.7 重组质粒电击转化感受态细胞
            3.2.2.8 农杆菌浸润接种
            3.2.2.9 病毒粒子电镜观察
            3.2.2.10 Western blot
            3.2.2.11 Northern blot
    3.3 结果与分析
        3.3.1 全长CWMV cDNA扩增与克隆
        3.3.2 CWMV cDNA克隆体外转录及其侵染性分析
        3.3.3 农杆菌浸润法接种CWMV侵染性克隆
        3.3.4 应用全长侵染性克隆分析CWMV温敏性
    3.4 小结与讨论
第4章 HSP70表达特性与CWMV侵染之间的关系分析
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 方法
            4.2.2.1 设计引物
            4.2.2.2 Trizol法提取植物RNA
            4.2.2.3 扩增目的基因及纯化
            4.2.2.4 克隆载体的构建
            4.2.2.5 基因沉默载体TRV:NbHSP70的构建
            4.2.2.6 瞬时过表达载体35S:NbHSP70和35S:TaHSP70构建
            4.2.2.7 Northern blot
            4.2.2.8 Western blot
            4.2.2.9 荧光定量PCR
    4.3 结果与分析
        4.3.1 CWMV侵染对宿主HSP70蛋白积累水平的影响
        4.3.2 抑制HSP70蛋白的积累对CWMV复制的影响
        4.3.3 CWMV侵染对HSP70的转录水平的影响
        4.3.4 沉默NbHSP70对CWMV复制的影响
        4.3.5 TaHSP70和NbHSP70过表达对CWMV的复制的影响
        4.3.6 NbHSP70对CWMV的RNA1复制的影响
    4.4 小结与讨论
第5章 HSP70和CWMV复制酶的互作分析
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 材料
        5.2.2 方法
            5.2.2.1 引物设计
            5.2.2.2 扩增与纯化目的基因
            5.2.2.3 构建重组载体
            5.2.2.4 转化农杆菌感受态
            5.2.2.5 农杆菌浸润接种
            5.2.2.6 荧光观察
            5.2.2.7 质粒转化酵母菌株
            5.2.2.8 ELISA实验
            5.2.2.9 Western blot
    5.3 结果与分析
        5.3.1 HSP70和CWMV复制酶的酵母双杂交实验分析
        5.3.2 基于ELISA的体外互作分析
            5.3.2.1 原核表达载体的构建
            5.3.2.2 pGEX-Rep~(1-333)、pET-HSP70蛋白诱导表达
            5.3.2.3 ELISA-based binding assays
        5.3.3 双分子荧光互补实验BiFC
        5.3.4 NbHSP70和TaHSP70的定位分析
        5.3.5 HSP70与CWMV复制酶的细胞定位分析
    5.4 小结与讨论
第6章 总结与展望
    6.1 总结
    6.2 展望
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间取得的研究成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]草莓镶脉病毒粒子提取及电镜观察[J]. 肖文斐,裘劼人,柳爱春,余红,来文国,童建新,张恒木,阮松林,马华升,忻雅,方献平.  湖北农业科学. 2014(18)
[2]禾谷多黏菌传小麦病毒病的分布及变化动态[J]. 孙炳剑,羊健,孙丽英,程兆榜,谢礼,姜鸿明,郑建强,赵倩,谢联辉,陈剑平.  麦类作物学报. 2011(05)
[3]热激蛋白的研究进展[J]. 王建义,慈忠玲.  山西林业科技. 2008(01)
[4]水稻黑条矮缩病毒p8蛋白的原核表达、抗血清制备及其特性[J]. 羊健,张恒木,陈剑平,戴良英.  植物保护学报. 2007(03)
[5]汉滩病毒感染细胞中Hsp70和NP的高表达及共定位（英文）[J]. 叶苓,刘彦仿,廖文俊,杨守京,王春梅.  Chinese Medical Journal. 2001(05)



本文编号：3647277