棉铃虫C型凝集素1参与细胞免疫和抗中华卵索线虫寄生的分子机理

发布时间：2022-06-03 19:21

　　包囊和吞噬作用是由血细胞介导的两种免疫反应,是昆虫先天免疫系统的重要组成部分。包囊作用是由多个血细胞参与的、针对较大的病原物（如寄生蜂的卵、病原线虫等）的清除,而吞噬作用是单个血细胞针对较小病原物（如细菌、病毒等）的清除。蜕皮激素的活化形式20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone,20E）作为调控昆虫蜕皮、变态、生殖、发育等过程的重要激素,也参与调节多种免疫应答,如细胞免疫（包囊和吞噬）。然而,目前我们对昆虫细胞免疫及其内分泌调控分子机制尚不清楚。本研究以棉铃虫（Helicoverpa armigera）为模型,首先统计了中华卵索线虫（Ovomermissinemsis 寄生后棉铃虫的死亡率,并分析了棉铃虫应答O.sinesis.寄生后的免疫反应。结果发现O.sinensis寄生后导致了棉铃虫存活率急剧下降,且寄生早期棉铃虫的血细胞吞噬能力和血浆抗菌活性显著升高。为了进一步获得识别O.sinensis并触发先天免疫反应的关键蛋白,我们将O.sinensis与棉铃虫变态期血浆孵育,经洗涤、洗脱后质谱鉴定,获得一个模式识别蛋白C-typelectin1b（HaCTL1b）,该... 

【文章页数】：69 页

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 昆虫免疫系统
        1.1.1 体液免疫
        1.1.2 细胞免疫
    1.2 包囊反应
    1.3 吞噬反应
    1.4 20-羟基蜕皮酮
    1.5 棉铃虫
    1.6 害虫防治
    1.7 研究背景及意义
2 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 棉铃虫
        2.1.2 白兔
        2.1.3 线虫
        2.1.4 菌株
        2.1.5 试剂、药品
        2.1.6 仪器与设备
        2.1.7 常用试剂及培养基的配置
        2.1.8 实验用到的引物序列
    2.2 实验方法
        2.2.1 中华卵索线虫寄生棉铃虫实验
        2.2.2 寄生中华卵索线虫的棉铃虫血细胞吞噬细菌实验
        2.2.3 寄生中华卵索线虫的棉铃虫血浆抗菌活性测定实验
        2.2.4 HaCTL1b基因全长、信号肽编码蛋白序列分析
        2.2.5 棉铃虫各组织RNA的提取
        2.2.6 合成cDNA第一链(TRANS Easy Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)
        2.2.7 cDNA的质量检测
        2.2.8 HaCTL1b基因的原核重组表达与纯化
        2.2.9 HaCTL1b抗体的制备
        2.2.10 Western blot抗体检测实验
        2.2.11 荧光定量分析HaCTL1基因的表达模式
        2.2.12 Western blot检测HaCTL1在棉铃虫不同发育阶段的蛋白水平表达模式
        2.2.13 rHaCTL1b的凝集和结合实验
        2.2.14 E.coli 和 aureus刺激HaCTL1的表达实验
        2.2.15 HaCTL1的RNA干扰实验
        2.2.16 检测HaCTL1敲降后对包囊率的影响
        2.2.17 检测孵育rHaCTL1b对包囊率的影响
        2.2.18 孵育rHaCTL1b对血细胞吞噬率的影响
        2.2.19 检测HaCTL1敲降后对血细胞吞噬率的影响
3 结果与分析
    3.1 中华卵索线虫寄生对棉铃虫存活率的影响
    3.2 中华卵索线虫寄生对棉铃虫免疫应答的影响
    3.3 棉铃虫HaCTL1b基因的鉴定与生物信息学分析
    3.4 rHaCTL1b的表达与纯化
        3.4.1 重组质粒pET-32a-HaCTL1b的构建
        3.4.2 阳性筛选结果
        3.4.3 重组蛋白rHaCTL1b的表达与纯化
    3.5 Anti-HaCTL1b抗血清识别rHaCTL1b和内源HaCTL1
    3.6 HaCTL1的组织特异性表达模式分析
    3.7 HaCTL1在不同发育阶段的表达分析
    3.8 20E诱导HaCTL1的表达
    3.9 Beads刺激诱导HaCTL1表达
    3.10 HaCTL1促进血细胞包囊
    3.11 rHaCTL1b促进细菌凝集
    3.12 rHaCTL1b与细菌结合活性分析
    3.13 细菌刺激诱导HaCTL1基因和蛋白的表达
    3.14 孵育rHaCTL1b促进血细胞吞噬率
    3.15 敲降HaCTL1降低血细胞吞噬率
4 讨论
5 小结与展望
参考文献
攻读硕士期间论文发表情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]诱杀技术在害虫综合治理（IPM）中的应用[J]. 闫凯莉,唐良德,吴建辉,毕志兼.  中国植保导刊. 2016(06)
[2]昆虫天然免疫反应研究前沿[J]. 初源,周帆,张明明,安春菊.  应用昆虫学报. 2013(02)
[3]昆虫免疫进化的研究进展[J]. 周琼.  福建农业学报. 2007(04)
[4]中华卵索线虫感染棉铃虫后的血淋巴病理学研究[J]. 陈伍国,骆启桂,王丹,高原.  华中师范大学学报(自然科学版). 2002(03)
[5]武昌罗索线虫（Romanomermis wuchangensis）生活史的研究[J]. 骆启桂.  华中师范大学学报(自然科学版). 1987(03)

硕士论文
[1]HaCTL3和HaGBPB介导20E信号调控棉铃虫细胞免疫的分子机理[D]. 卓晓蓉.华中师范大学 2018
[2]武昌罗索线虫性别分化差异基因筛选及功能研究[D]. 陶斯莹.华中师范大学 2018
[3]棉铃虫两种C-型凝集素HaCTL3和HaCTL7的功能研究[D]. 张旗.华中师范大学 2013



本文编号：3653331