蜡样芽孢杆菌磷酸二酯酶影响生物膜的形成及棉铃虫毒性作用
发布时间：2022-07-20 11:17
磷酸二酯酶（PDEs）是细胞广泛存在的一类水解酶,通过水解诸如环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟苷（cGMP）等物质的磷酸二酯键,调节细胞内的多种信号传导和生理活动。目前已从生物细胞中发现具有不同结构的11种PDEs。不同种类的PDEs在细胞内分布、表达、调节方式以及对抑制剂的耐受性存在差异,发挥不同的生理功能。YmdB最初发现是存在于枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）中的一种PDE,参与调节细菌的生物膜形成、运动性、胞外多糖产生、双稳定性等多种生理性状。蜡样芽孢杆菌0-9是前期研究中获得的一株小麦土传病害生防细菌,可以定殖在小麦根部,并且具有易于培养鉴定、形成生物膜和运动能力等。通过分析0-9菌株基因组中的编码基因的氨基酸序列,发现存在一个基因其氨基酸序列与及subtB.is中YmdB具有34%的同源性,同时发现二者具有相似的结构。该基因及其编码产物在蜡样芽孢杆菌中的功能尚没有报道。在此,我们通过基因敲除和回补研究该基因（暂命名为ymdB）的功能,分析该基因对于生物膜形成和对于棉铃虫致病性的影响。为了分析ymdB基因的功能,利用同源重组的方法构建ymdB基因缺失菌株即Δy...
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 前言
1.1 磷酸二酯酶(PDEs)
1.1.1 磷酸二酯酶的分类及功能
1.1.2 细菌中的磷酸二酯酶(PDEs)
1.1.3 PDEs水解底物cAMP、cGMP在细菌中的调节
1.1.4 磷酸二酯酶编码基因ymdB
1.2 微生物生物膜
1.2.1 生物膜的简介
1.2.2 生物膜中的组成成分及形成过程
1.2.3 生物膜的形成机制
1.3 立题依据
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 引物设计
2.1.3 培养基
2.1.4 所用试剂
2.2 实验方法
2.2.1 感受态制备方法
2.2.2 基因缺失菌株的构建
2.2.3 基因互补菌株的构建
2.2.4 YmdB蛋白表达菌株的构建
2.2.5 YmdB蛋白诱导纯化及酶活测定方法
2.2.6 生物学性状的测定
2.2.7 生物膜形成能力的测定及棉铃虫毒性作用
2.2.8 蛋白免疫印记(Western blot)方法
2.2.9 RNA的提取、反转录及实时定量PCR方法
3 结果与分析
3.1 基因缺失菌株及互补菌株构建
3.1.1 ymdB基因缺失菌株构建
3.1.2 ymdB/sinR和ymdB/sinI基因缺失菌株构建
3.1.3 基因互补菌株构建
3.2 ymdB基因缺失对B.cereus 0-9生理功能的影响
3.2.1 ymdB基因对B.cereus 0-9菌落形态的影响
3.2.2 ymdB基因对B.cereus 0-9菌落群体生长及盐敏感性的影响
3.2.3 基因缺失对B.cereus 0-9菌株运动能力的影响
3.2.4 ymdB基因缺失对B.cereus 0-9胞外蛋白酶形成能力的影响
3.2.5 ymdB基因缺失对B.cereus 0-9芽孢形成能力的影响
3.2.6 ymdB基因缺失对B.cereus 0-9菌株的溶血能力的影响
3.3 ymdB基因编码产物是一种磷酸二酯酶
3.3.1 ymdB基因蛋白表达菌株的构建
3.3.2 YmdB蛋白的诱导表达及纯化
3.3.3 YmdB蛋白酶活的测定
3.4 YmdB对B.cereus 0-9的生物膜形成的影响
3.4.1 YmdB参与B.cereus 0-9的生物膜形成
3.4.2 测定YmdB是否通过SinR/SinI调控对生物膜形成的影响
3.4.3 受SinR调控的基因在B.cereus 0-9、AymdB的表达量
3.4.4 与生物膜形成有关的生物学性状的测定
3.5 测定YmdB蛋白和ymdB基因在B.cereus 0-9中的表达量
3.6 YmdB对参与B.cereus 0-9对棉铃虫毒性的作用
4 结论
5 讨论
参考文献
致谢
本文编号：3663897
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【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 前言
1.1 磷酸二酯酶(PDEs)
1.1.1 磷酸二酯酶的分类及功能
1.1.2 细菌中的磷酸二酯酶(PDEs)
1.1.3 PDEs水解底物cAMP、cGMP在细菌中的调节
1.1.4 磷酸二酯酶编码基因ymdB
1.2 微生物生物膜
1.2.1 生物膜的简介
1.2.2 生物膜中的组成成分及形成过程
1.2.3 生物膜的形成机制
1.3 立题依据
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 引物设计
2.1.3 培养基
2.1.4 所用试剂
2.2 实验方法
2.2.1 感受态制备方法
2.2.2 基因缺失菌株的构建
2.2.3 基因互补菌株的构建
2.2.4 YmdB蛋白表达菌株的构建
2.2.5 YmdB蛋白诱导纯化及酶活测定方法
2.2.6 生物学性状的测定
2.2.7 生物膜形成能力的测定及棉铃虫毒性作用
2.2.8 蛋白免疫印记(Western blot)方法
2.2.9 RNA的提取、反转录及实时定量PCR方法
3 结果与分析
3.1 基因缺失菌株及互补菌株构建
3.1.1 ymdB基因缺失菌株构建
3.1.2 ymdB/sinR和ymdB/sinI基因缺失菌株构建
3.1.3 基因互补菌株构建
3.2 ymdB基因缺失对B.cereus 0-9生理功能的影响
3.2.1 ymdB基因对B.cereus 0-9菌落形态的影响
3.2.2 ymdB基因对B.cereus 0-9菌落群体生长及盐敏感性的影响
3.2.3 基因缺失对B.cereus 0-9菌株运动能力的影响
3.2.4 ymdB基因缺失对B.cereus 0-9胞外蛋白酶形成能力的影响
3.2.5 ymdB基因缺失对B.cereus 0-9芽孢形成能力的影响
3.2.6 ymdB基因缺失对B.cereus 0-9菌株的溶血能力的影响
3.3 ymdB基因编码产物是一种磷酸二酯酶
3.3.1 ymdB基因蛋白表达菌株的构建
3.3.2 YmdB蛋白的诱导表达及纯化
3.3.3 YmdB蛋白酶活的测定
3.4 YmdB对B.cereus 0-9的生物膜形成的影响
3.4.1 YmdB参与B.cereus 0-9的生物膜形成
3.4.2 测定YmdB是否通过SinR/SinI调控对生物膜形成的影响
3.4.3 受SinR调控的基因在B.cereus 0-9、AymdB的表达量
3.4.4 与生物膜形成有关的生物学性状的测定
3.5 测定YmdB蛋白和ymdB基因在B.cereus 0-9中的表达量
3.6 YmdB对参与B.cereus 0-9对棉铃虫毒性的作用
4 结论
5 讨论
参考文献
致谢
本文编号：3663897
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