水貂阿留申疾病的双重PCR检测方法建立及其应用

发布时间：2022-07-22 15:08

　　水貂阿留申病（Aleutian Mink Disease,AMD）作为毛皮动物三大疫病之一,对水貂养殖业造成巨大的经济损失。因其特殊的发病机理,尚无有效的药物或疫苗来防治此病,只能通过对貂群检疫净化淘汰来控制病情。目前主要采用的针对抗体检测的对流免疫电泳法（CIEP）在对阿留申疾病的发病前期检测存在敏感性差问题,并且对部分康复水貂检测仍显示阳性,不利于进行阿留申病的抗病育种筛选;以及近年来随着阿留申病毒的不断传播和变异,普通病原检测方法常出现漏检的状况。双重PCR方法在检测多种病原微生物感染时具有省时省力、简单快速、敏感高、特异强等优点,已在多种病毒的鉴定与检测中得到了广泛应用。目前,在我国水貂群中AMDV普遍存在,应用双重PCR方法检测AMDV的方法还没有建立。本研究通过参考GenBank上已发表的AMDV序列进行比对,选择在NS1基因的保守区和VP2基因的保守区分别设计一对针对NS1基因片段的特异性引物NS1-F/NS1-R和一对针对VP2基因片段的特异性引物VP2-F/VP2-R,建立双重PCR检测方法。通过单一PCR均能扩增出相应的目的条带:NS1目的片段为568bp,VP2目... 

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

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符号说明
中文摘要
Abstract
1.前言
    1.1 病原学
        1.1.1 病原学分类
        1.1.2 病毒粒子的形态结构和理化特性
        1.1.3 ADV毒株及培养特性
        1.1.4 AMDV的分子生物特征
            1.1.4.1 AMDV基因组
            1.1.4.2 AMDV基因的复制和转录
            1.1.4.3 AMDV的蛋白及其功能
    1.2 AMDV的流行病学
        1.2.1 AMDV的宿主
        1.2.2 AMDV的传播方式
        1.2.3 AMDV的发病机制
        1.2.4 AMDV的临床症状
        1.2.5 AMDV病理变化
    1.3 AMDV的诊断
        1.3.1 病原学诊断
        1.3.2 血清学诊断
            1.3.2.1 碘凝集实验(IAT)
            1.3.2.2 对流免疫电泳(CIEP)
            1.3.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)
            1.3.2.4 间接免疫荧光试验(IIF)
            1.3.2.5 补体结合实验(CF)
            1.3.2.6 免疫复合物检测法(CIC)
            1.3.2.7 淋巴细胞酯酶标记
            1.3.2.8 酶标斑点纸条法
        1.3.3 分子生物学诊断
            1.3.3.1 聚合酶链式反应(PCR)
            1.3.3.2 核酸杂交技术
            1.3.3.3 基因检测芯片
            1.3.3.4 环介导等温扩增技术(LAMP)
    1.4 水貂示范场生物安全体系的建立
        1.4.1 水貂示范场外部环境生物安全体系建立
        1.4.2 水貂示范场内部环境生物安全体系建立
            1.4.2.1 动物疫病的防控
            1.4.2.2 加强日常管理
            1.4.2.3 加强引种监测
            1.4.2.4 完善防疫制度
            1.4.2.5 疫苗预防和药物治疗
            1.4.2.6 定期疾病检测
    1.5 本研究的目的及意义
2.材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 实验样品
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 菌种与质粒
    2.2 方法
        2.2.1 试剂的配制
        2.2.2 引物设计
        2.2.3 采用 DNA 试剂盒对样品组织进行 DNA 的提取
        2.2.4 NS1和VP2片段的PCR扩增
        2.2.5 PCR产物回收纯化
        2.2.6 重组载体构建
        2.2.7 DH5α感受态细胞制备
        2.2.8 连接产物的转化
        2.2.9 重组质粒的提取
        2.2.10 重组质粒的酶切鉴定
    2.3 单重PCR方法建立
        2.3.1 单重PCR目的条带的优化
        2.3.2 单重PCR特异性试验
        2.3.3 单重PCR敏感性试验
        2.3.4 单重PCR重复性试验
    2.4 双重PCR方法建立
        2.4.1 双重PCR反应条件的优化
        2.4.2 双重PCR特异性试验
        2.4.3 双重PCR敏感性试验
        2.4.4 双重PCR重复性试验
    2.5 山东地区某示范水貂场AMDV的检疫净化
3.结果
    3.1 NS1和VP2基因片段的PCR扩增结果
    3.2 重组载体的酶切鉴定结果
    3.3 测序结果与样品毒株比较
    3.4 单重PCR测试结果
        3.4.1 单重PCR目的片段优化结果
        3.4.2 单重PCR特异性试验的结果
        3.4.3 单重PCR敏感性试验结果
        3.4.4 单重PCR重复性试验
    3.5 双重PCR检测结果
        3.5.1 双重PCR反应条件的优化
        3.5.2 双重PCR特异性试验
        3.5.3 双重PCR的敏感性试验
        3.5.4 双重PCR重复性试验
    3.6 山东地区某水貂示范场AMDV的检测结果
4.讨论
    4.1 双重PCR方法的建立
    4.2 阿留申疾病的检疫
5.结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]水貂阿留申病的诊断与防治[J]. 李存美.  山东畜牧兽医. 2017(01)
[2]对流免疫电泳在水貂阿留申病诊断中的应用进展[J]. 庄金秋,梅建国,王玉茂,姚春阳,赵元楷.  经济动物学报. 2015(03)
[3]水貂阿留申病毒环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立[J]. 田国宁,张金玲,李凯,田国华,丁葵英.  中国动物检疫. 2015(06)
[4]水貂血液阿留申病病毒及其抗体的检测与分析[J]. 邵西群,章秀婷,岳志刚,荣敏,闫喜军,杨福合.  中国兽医学报. 2014(12)
[5]中国毛皮产业发展历程与现状分析[J]. 郑策,张旭,全颖,凌立莹,刘彦.  特产研究. 2013(03)
[6]水貂养殖的研究进展[J]. 罗佳捷,张彬,王洁,陈登科.  饲料博览. 2013(03)
[7]水貂阿留申病毒结构蛋白与非结构蛋白的研究进展[J]. 甘露,刘立兵,时坤,李健明,杜锐.  经济动物学报. 2012(03)
[8]水貂的繁殖生理特性[J]. 王华.  特种经济动植物. 2012(04)
[9]水貂阿留申病的研究进展[J]. 王克祥,刘永逵,孙宏磊.  中国畜牧兽医. 2010(12)
[10]水貂阿留申病毒的分子生物学研究进展[J]. 刘晓,刁燕,杜锐.  经济动物学报. 2010(01)

硕士论文
[1]水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用[D]. 韩铠怿.山东农业大学 2016
[2]养殖水貂阿留申病感染情况及分子流行病学的研究[D]. 马建.东北林业大学 2005



本文编号：3664837